神经生长因子对牙周炎犬即刻种植骨结合影响的实验研究

张 艳，王 伟，刘 新，袁 琳，刘 聪

(1.吉林大学中日联谊医院 口腔科，吉林 长春130033;2.泰安市中心医院 口腔科，山东 泰安271000)

牙周炎在世界范围内发病率高达90%，已成为了成年人牙缺失的最主要原因。目前，种植修复是牙缺失患者极为重要的修复方法之一。牙周炎虽然不是口腔种植修复的绝对禁忌症，但种植失败风险较高，尤其即刻种植。因此，如何提高牙周炎患者拔牙后即刻种植的成功率是目前研究的热点。

神经生长因子(NGF)具有促进骨折愈合的能力[1,2]。NGF能促进血管生成，且在不同钛表面能提高内皮细胞增殖和基因的表达，并有抗炎作用，可能对种植体周围早期骨结合有一定促进作用[3-6]。但目前鲜有NGF对牙周炎患者拔牙即刻种植早期骨结合影响的文献报道。为观察NGF对牙周炎犬即刻种植早期骨愈合的影响，本实验建立犬前磨牙牙周炎模型，拔牙后行即刻种植术并局部应用NGF，以期为临床牙周炎即刻种植后局部应用NGF提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4只成年雄性健康比格犬，体健，口腔卫生条件良好，无任何口腔疾病。

1.2 实验材料

6号丝线、正畸结扎丝、牙周探针、高速涡轮手机、金刚砂车针、牙龈卟啉单胞菌(由吉林大学白求恩医学部基础实验室提供)、韩国Mega种植体(直径3.3 mm，长7 mm)、注射用鼠NGF(丽康乐)[丽珠集团丽珠制药厂，珠海，批准文号：国药准字S20100005]临用前每瓶用2 ml氯化钠注射液溶解。

1.3 实验方法

1.3.1犬牙周炎模型的建立 全身麻醉后，左、右两侧所有前磨牙牙颈部下使用涡轮手机制备一浅沟，正畸结扎丝及事先浸泡过牙龈卟啉单胞菌的6号丝线进行结扎，在饲料中添加全脂奶粉、蔗糖各20 g，并在牙颈部每日涂抹牙龈卟啉单胞菌，每周对犬的牙周进行观察和探诊。观察指标为：出血指数(bleeding index,BI)、菌斑指数(plaque index,PLI)。第4周末建模完成后，全麻下拆除丝线及结扎丝对犬的全口牙齿进行牙周洁治，并拍摄螺旋CT，三维重建后测量釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离视为牙槽骨吸收量。

1.3.2种植手术及术后处理 第5周，集中一天由一名临床经验丰富的种植医师对4只犬拔牙后行即刻种植术。全麻后，微创拔除左、右侧下颌第二、三前磨牙，逐级扩孔，即刻植入Mega种植体16枚，植入扭矩35N.cm以上，可吸收缝线严密缝合。术后流质饮食，肌注青霉素钠48万U/只/天3天。选择右侧下颌作为对照组，左侧下颌即为实验组。实验组在种植体周围骨膜下颊、舌侧注射NGF，剂量为1.0 μg/d，注射2周；对照组种植体周围骨膜颊、舌侧注射相同体积的0.9%生理盐水。术后4、8周各随机选择两只犬用过量麻醉法处死，取含种植体的犬下颌骨标本，生理盐水冲洗、作好标记后，10%的福尔马林溶液浸泡备用。

1.4 观察指标

1.4.1大体观察 观察种植术后植体有无松动及周围软组织有无感染、炎症和愈合状况。

1.4.2X线观察 对种植体及周围软、硬组织行X线检查，观察种植体周围骨密度及结合状况。

1.4.3组织形态学观察 将标本放在清水下连续冲洗12 h，不同浓度梯度酒精脱水、包埋，莱卡硬组织切片机切片，磨至厚度约为80 μm的磨片，甲苯胺蓝染色，Olympus光学显微镜进行种植体-骨整合的观察。

1.4.4骨计量学分析及数据处理 应用Image-pro plus 6.0对每个植体的骨结合率进行计算，选择种植体颊侧及舌侧作为观察区域。骨结合率为种植体与新生骨组织接触的长度与种植体在骨界面的长度的比值乘以100%。对所有实验数据应用SPASS17.0进行处理，并采用单因素方差分析进行比较。当P<0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 牙周炎模型及评估

2周后下颌两侧前磨牙的牙龈出现炎症症状：牙龈红肿充血，探诊容易出血，BI为1-3， PLI为1-2。结扎4周后，下颌前磨牙牙颈部可见大量的牙菌斑及软垢、探及牙石，BI为3-4， PLI为2-3，牙齿松动Ⅰ-Ⅱ度，螺旋CT三维重建显示下颌前磨牙处的牙槽嵴顶明显吸收，为牙周炎的临床表现，提示牙周炎犬动物实验模型建立成功。对两组2、4周BI、PLI及4周牙槽骨吸收量进行对比分析(表1)，结果均显示差异不显著(P>0.05)。

2.2 大体观察

术后实验动物进食、活动正常，均无死亡。手术部位愈合良好，未发生炎症反应及手术并发症，未出现植体的松动、脱落，金属口镜柄端敲击种植体顶部声响清脆。

表1 4周下颌骨两侧第二、三前磨牙牙槽骨吸收量对比

2.3 X线观察

X线片上未显示异常骨吸收区域。术后4周，对照组与实验组植体周围均显示有放射性透射区，与实验组相比，对照组种植体周围透射区明显。术后8周，较4周各组种植体周围区域与正常骨组织更接近，对照组与实验组相比种植体周围投射区稍明显(图1)。

A：4周对照组；B：4周实验组；C：8周对照组；D：8周实验组

2.4 组织形态学观察

术后4周：对照组植体与骨组织之间有部分结合，较多的纤维结蹄组织形成，可见类骨质，骨小梁比较稀疏；实验组植体与骨组织之间结合区域相对较多，相对较少的纤维结缔组织成分，类骨质开始形成，连续的骨小梁出现。术后8周：两组种植体周围骨组织均较4周时更成熟、致密。对照组，新生骨组织较多，骨小梁比较规则；实验组类骨质矿化程度高，骨小梁均匀整齐，新生骨组织致密，骨组织直接与种植体结合范围更广(图2)。

A：4周对照组；B：4周实验组；C：8周对照组；D：8周实验组

2.5 骨计量学分析

术后4、8周：对照组种植体骨结合率明显低于实验组，单因素方差分析两组P均小于0.05，差异具有统计学意义(表2)。

3 讨论

牙周炎是由细菌引起的牙周组织的进行性破坏性疾病，伴随牙周袋形成和炎症、进行性的附着丧失和牙槽骨的吸收。多种因素影响着牙周炎患者即刻种植的成功，良好的初期稳定性是口腔种植成功的先决条件[7]。研究表明，术后4、8周牙周感染部位的种植相对于健康部位种植骨愈合率低[8]。牙周炎患者拔牙后牙槽窝的形态、局部炎症及剩余骨量都可能影响植体的初期稳定性，从而增加即刻种植失败的风险。

表2 术后4、8周后的种植体骨结合率

NGF是具有营养神经元和促进突触生长功能的一种多胎蛋白，具有骨折愈合的潜能[1,2]。血管的生成对于种植体周围骨再生和骨结合非常重要，Lazarovici等[3]证明了NGF与血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)一样具有促进血管生成的能力。Guang等[4]通过实验研究发现NGF可以促进钛表面血管形成和基因的表达。王亮等[5]经过对兔股骨种植体周围NGF的表达研究发现NGF的表达和骨愈合细胞的功能成正比。鲍艳娜等[9]将NGF应用于兔下颌骨种植，发现NGF能缩短骨组织愈合时间，并提高种植体骨结合率。NGF可以提高骨相关蛋白的表达，促进细胞成骨分化，增强牙周成纤维细胞成骨性[10,11]。汪琼等研究NGF对成骨细胞基因表达的影响发现，NGF可减少NO释放从而发挥抗炎作用[6]。

良好牙周炎动物实验模型的建立是至关重要的。犬与人类的牙周组织结构相似，且一生同样有乳、恒牙两副牙齿。尤其比格犬性格温顺、大小适宜，常被用于牙周病的动物实验模型研究[12,13]。建立动物牙周炎实验模型主要有：结扎法[14]、细菌涂抹法[15]、高塘黏性饮食法[16]等方式。为确保牙周炎犬动物实验模型的成功建立，本实验采用了以上3种方法联合进行造模。4周后所有犬左右两侧下颌前磨牙区均表现出牙龈炎症、探诊出血、牙齿松动及牙槽嵴顶吸收的牙周炎临床表现，提示造模成功。

本研究成功建立比格犬牙周炎模型后，拔出双侧下颌第二、三前磨牙后行即刻种植，并在种植体周围局部注射NGF，术后4、8周，x线显示实验组种植体周围透射影均小于对照组，组织形态学显示实验组种植体周围新生骨量明显高于对照组，骨计量学分析显示实验组骨结合率明显高于对照组，并且差异均具有有统计学意义。NGF局部应用于牙周炎拔牙后即刻种植，同样可以加速种植体周围新生骨的生成、促进骨愈合，并提高种植体骨结合率，但其具体机制尚未完全明确，局部应用NGF作为一种牙周炎种植的辅助手段应用于临床还需进一步研究。