血清miR-21对结直肠癌肝转移预测价值的评价

肖 霞，马 慧，王 欣

(吉林大学第二医院 检验科,吉林 长春130041)

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，已成为我国第五大癌症杀手，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，临床上大约40%的结直肠癌患者死于肝脏的转移[1]。 大约15%-25%的结直肠癌患者在确诊时即有肝转移，如不采取有效治疗，中位生存时间仅为5-10 个月。因此，结直肠癌肝转移的早期预测及诊断在临床上尤为重要。目前，临床上常用的结直肠癌肝转移的诊断指标价值有限[2]。 因此，微创、准确和可重复的检测指标迫切需要，血清或血浆作为临床样品为结直肠癌肝转移的早期预测提供了可能。

血清或血浆中微小RNA(micro RNAs，miRNAs)可以在不同的环境条件下，例如，pH、温度和多次反复冻融后仍能长时间稳定的存在，被认为是一种理想的血液标志物[3]。研究发现miR-21在多种肿瘤的发生发展过程中起重要作用，参与肿瘤的发生、发展和侵袭过程[4]。因此，在本研究中，我们以期通过单独及联合评价血清中miR-21对结直肠癌肝转移的预测价值，以期为临床的结直肠癌肝转移的预测提供一种潜在的辅助诊断方法。

1 对象与方法

1.1 研究对象

病例组：签署患者知情同意书，募集2014年1月-2015年12月在本院就诊的晚期结直肠癌无肝转移患者146例，其中女性62例，男性84例，平均年龄为56.2±10.7岁。同期纳入晚期结直肠癌伴肝转移患者124例，其中女性58例，男性66例，平均年龄为57.1±12.1岁。两组比较后，年龄与性别均无统计学差异。

1.2 miR-21的提取及检测

采集患者清晨空腹血，离心后分离抽提上清得到血清。 miR-21的提取按照操作说明使用mirVana PARIS kit (AM1556，Ambion)试剂盒，提取200 μl血清的total RNA，Dnase I降解残余的DNA，然后按照操作说明，使用TaqMan microRNA RT kit (4366596，Ambion)试剂盒进行miR-21的反转录。反转录体系包括2.5 μl的total RNA、0.75 μl的10×Reverse Transcription Buffer、 2.08 μl的DEPC水、0.075 μl的dNTPs、0.095 μL的反转录抑制酶、0.5 μl的反转录酶和1.5 μl的20×miRNA-specific primer)，发转录程序为16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。得到反转录产物后，按照操作说明，对反转录产物进行扩增，miRNA-21的扩增体系包括5.0 μl的TaqMan Gene Expression Master Mix、4.5 μl 的反转录产物和 0.5 μl的 5×TaqMan MicroRNA Assay。扩增程序为95℃ 5min，然后40个cycel的95℃，15 sec，60℃ 1 min。内参为U6 miRNA，使用ABI PRISM 7500进行miR-21和U6的检测，2-ΔΔCt法计算miR-21的相对表达量。

1.3 统计分析

本研究数据采用SPSS21.0软件分析，CEA的浓度以中位数表示，miR-21的相对表达值以均数±标准差表示。miR-21和CEA联合诊断采用二元Logistic回归分析。受试者工作特征曲线下面积(Area under curve，AUC)，灵敏度和特异度评价指标的预测价值。AUC的统计学比较采用z-score检验[5]。P<0.05代表差异具有统计学价值。

2 结果

2.1 CEA和miR-21在两组之间的比较

与结直肠癌无肝转移组相比，结直肠癌伴随肝转移组的CEA和miR-21均显著升高(P<0.05)。

表1 CEA和miR-21在结直肠癌无肝转移组相比，结直肠癌伴随肝转移组的比较

2.2 CEA和miR-21单独区分结直肠癌无肝转移组和结直肠癌伴随肝转移组的诊断价值评价

当CEA和miR-21单独区分结直肠癌无肝转移组和结直肠癌伴随肝转移组的诊断价值时，CEA的敏感性和特异性分别为54.84%和58.22%，miR-21的敏感性和特异性分别为69.35%和85.62%。

表2 CEA和miR-21单独区分结直肠癌无肝转移组和结直肠癌伴随肝转移组的诊断价值评价

2.3 CEA和miR-21联合区分结直肠癌无肝转移组和结直肠癌伴随肝转移组的诊断价值评价

当CEA和miR-21联合区分结直肠癌无肝转移组和结直肠癌伴随肝转移组的诊断价值评价，其曲线下面积为0.86，置信区间为0.82至0.91。两者联合检测后其敏感性和特异性分别为91.94%和51.23%，其AUC与CEA和miR-21的AUC相比较，均显著提高(P<0.05)。

3 讨论

结直肠癌的肝脏转移是一个多因素及多基因参与、多步骤和多阶段进展的过程。 经过多年的研究，其可能的机制目前主要表现在以下几方面：(1) 细胞外基质的降解过程，由于肿瘤发生转移涉及到细胞外基质的降解，通过与其表面的受体相结合形成肿瘤转移的通道； (2) 调控血管生成类因子的生成。肿瘤可持续性生长的基础是新生的血管，与此同时，新生血管形成引发的细胞粘附系统崩溃，使肿瘤癌细胞脱离原发组织，这是启动肿瘤侵袭转移的关键； (3) 细胞粘附的改变。肿瘤细胞间的同质粘附力较弱，容易从原发灶中脱离从而发生转移过程；(4) 趋化因子及其受体等其他相关因素[5,6]。虽然有大量的研究，然而，目前，临床上尚缺乏有效的结直肠癌肝转移预测标志物。

图1 CEA和miR-21联合区分结直肠癌无肝转移组和结直肠癌伴随肝转移组的诊断价值评价

CEA作为诊断和监测结直肠癌预后的有效标志物，作为结直肠癌术后的监控指标已作为标准检测进入治疗指南[7]。同时，CEA也可以用于判断结直肠癌患者生存率及与肝转移的关系[8]，大量的研究证实CEA参与结肠癌的肝脏转移，且可以通过抵抗肿瘤细胞的凋亡来延长肿瘤细胞的生存期，还可以刺激并促进抗炎细胞因子进而抑制体内对肿瘤细胞的杀伤。目前，有研究结果显示CEA术前水平与患者的预后相关，但临床诊断中利用术前CEA水平来评估结直肠癌肝脏转移尚且存在一定的争论。在本研究中，其用于区分结直肠癌肝转移与否的诊断敏感性和特异性分别为54.84%和58.22%。这与之前的研究结果不同，可能由于本研究纳入的样本量较少及不同分期的标本量有关。

miR-21基因作为最早被检测到的miRNA基因之一，在肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移过程中起重要作用，有报道发现，在一些肿瘤细胞系中均发现miR-21基因表达上调。PDCD4作为miR-21的靶基因之一，是细胞凋亡的关键因子，通过下调癌基因的来抑制肿瘤的发生发展和转移[9]，因此 miR-21-PDCD4可能是一个重要的肿瘤发生发展的通路。PTEN也是miR-21的靶点之一，PTEN的抑癌作用主要通过调节PI3K/AKT信号通路实现，miR-21通过调节PTEN，进而调节细胞的增殖、凋亡和血管生成等生物学功能[10]。在本研究中，miR-21作为区分结直肠癌肝转移与否的诊断敏感性和特异性分别为69.35%和85.62%，具有一定的诊断价值。

本研究通过探讨血清中miR-21对结直肠癌肝转移的预测价值，评价其单独检测和联合CEA检测对于结直肠癌肝转移的辅助诊断价值。证明miR-21对于结直肠癌肝转移具有一定的辅助诊断价值，与CEA联合检测可以为临床结直肠癌肝转移的预测提供辅助诊断。