油桐花水提物干预烧伤大鼠Bcl—2、Bax表达的研究

李金凤 王永萍

【摘 要】 目的：通过研究油桐花水提物外用对烧伤大鼠的影响，并探索其对Bcl-2、Bax基因表达的影响。方法：60只Wistar大鼠，随机分为6组，每组10只。除正常组外其余5组建立大鼠深Ⅱ度烧伤模型，并对其进行相应药物治疗。待伤势恢复后，相机拍摄各组患处，处理取材。用Elisa和免疫组化法检测Bcl-2和Bax的表达情况。结果：Elisa检测表明，与模型组比较，各用药组血清中Bcl-2表达明显上调（P<0.01）；HE染色结果显示，模型组有大量纤维组织增生及炎性细胞浸润，各用药组炎性细胞浸润缓解；免疫组化实验结果显示，与模型组比较，各用药组与正常组促凋亡因子Bax表达水平比较明显降低；各治疗组中抗凋亡因子Bcl-2表达水平均有上调。结论：油桐花水煎剂对大鼠烧伤有明显治疗作用，与阳性药物烧烫伤膏作用相似，可抑制细胞凋亡，有利于恢复烧烫伤创面。

【关键词】 油桐花；烧烫伤；Bcl-2；Bax；凋亡

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）14-0014-05

Abstract：Objective To study the effect of external application of water extract of Tung Flower flower on burned rats and explore its influence on the expression of Bcl-2 and Bax gene. Methods Sixty Wistar rats were randomly divided into 6 groups of 10 each. Rats with deep second degree burns were established in the other 5 groups except the normal group and treated with corresponding drugs. After the injury recovers， the camera photographs the affected area and processes the materials. The expression of Bcl-2 and Bax was detected by Elisa and immunohistochemistry. Results Elisa test showed that the expression of Bcl-2 in the serum of each drug group was significantly increased compared with the model group （P<0.01）. The results of HE staining showed that the model group had a large number of fibrous tissue proliferation and inflammatory cell infiltration， and the inflammatory cell infiltration in each drug group relieved. The results of immunohistochemistry showed that compared with the model group， the expression level of pro-apoptosis factor Bax was significantly decreased in each drug group and normal group； the expression level of anti-apoptosis factor Bcl-2 was up-regulated in each treatment group. Conclusion Tung oil flower decoction has obvious curative effect on burns in rats. Similar to the burn and burn cream on the market， it can inhibit cell apoptosis and is beneficial to the recovery of burn wounds.

Keywords：Tung Flower；Burn and Scald； Bcl-2； Bax； Apoptosis

中医认为烧烫伤属于“烫火伤”范畴，常因外袭火毒，灼溃皮肤，皮肉焦卷，疼痛难忍甚至伤筋动骨，有些患者因火毒内攻，出现较重的全身症状[1]。油桐花具有消肿、镇痛、止血、生肌、促进伤口愈合等作用[2]，在烧烫伤治疗方面，有很好的疗效[3-4]。作为凋亡家族中最主要成员，Bcl-2与Bax在烧伤中也有重要作用[5-6]。但目前未见桐子花水提物调节Bcl-2与Bax表达干预烧烫伤相关文献报道。实验拟通过油桐花水提液调节凋亡蛋白Bcl-2、Bax干预烧烫伤，初步确定油桐花对烧烫伤的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠60只，体重（150±20）g，适应性喂养一周，购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK（湘）2014-0011。

1.2 药品与试剂 油桐花采自贵州省遵义市正安县并由贵阳中医学院孙庆文教授鉴定，无水乙醇（批号：20150601，重庆川东化工集团有限公司），二甲苯（批号：20150508，重庆茂业化学试剂有限公司），烧烫伤膏（批号：20150601，长春海外制药集团有限公司），苏木素染色液（批号：AR1180-1，博士德生物有限公司），伊紅染色液（批号：AR1180-2，博士德生物有限公司），Elisa检测试剂盒（批号：CK-E30187R，上海研辉生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器 FW177中草药粉粹机（天津市泰斯特仪器有限公司），DZKW-4水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司），FA2204N电子天平（上海箐海仪器有限公司），BCD-219冰箱（上海上菱白富乐），RE-5210旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），KD-BM组织包埋机（浙江金华科迪），XSZ-HS3生物显微镜（重庆光学仪器厂），YD-335石蜡切片机（浙江金华益迪医疗设备厂）。

2 方法

2.1 药材处理 将采摘的新鲜油桐花晒干，再用粉碎机将其粉碎，装在塑料袋中封存，备用。

2.2 油桐花水提物制备 精取油桐花粉末25g，装入盛有250mL蒸馏水的圆底烧瓶，浸泡30min，酒精灯加热回流2h，纱布过滤3次，合并3次滤液，并将纱布中残留的液体压出。将滤液倒入蒸发皿中，水浴锅加热浓缩。按照上述步骤依次提取浓缩制得不同浓度（0.1g·mL-1、0.3g·mL-1、0.6g·mL-1）油桐花水提物，即高、中、低剂量组。

2.3 分组及造模 实验大鼠适应喂养一周，随机分为6组，分别为正常组、模型组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组10只。按照“从左到右，从上到下”标记，用剪刀剪去长毛后，20%硫化钠脱毛。脱毛24h后称重，腹腔注射10%水合氯醛，待其充分麻醉后，使用台式超级控温烫伤仪对大鼠进行烫伤，设置温度为120℃，探头实际温度为90℃，烫伤时间为18s。烫伤后用纱布覆盖或升高室内温度以保持大鼠体温恒定，防止大鼠麻醉烫伤后体温过低而死亡。烫伤3d后，剪取正常组和造模组背部烧伤皮肤组织，放入4%多聚甲醛溶液固定，做HE染色，观察模型是否成功，造模成功病理切片显示炎性浸润严重。如图1所示。

2.4 给药 用棉签蘸取相应药物对各组烧伤大鼠创面进行均匀涂抹（模型组除外，高、中、低剂量组每次均涂抹1mL左右，其中阳性对照组为市面上销售的烧烫伤膏），每日1次，连续3周[7-9]。阳性对照组给药剂量约为0.13g·kg-1，高劑量用0.6g·mL-1油桐花水提液，中剂量用0.3g·mL-1油桐花水提液，低剂量用0.1g·mL-1油桐花水提液。

2.5 标本采集处理 于用药3周对各组大鼠背部进行图片给采集。大鼠断头取血，收集血液，离心机3000 rpm离心10min，取血清，标记好-80℃保存。剪取各组大鼠背部烧伤皮肤组织，放入4%多聚甲醛溶液固定，备用。

2.6 Elisa试剂盒检测 取出板条，室温均衡20min。标准品孔与样本孔加样。加入辣根过氧化物酶100μL。封闭反应孔，37℃水浴锅60min。弃液体，滤纸拍干。洗涤液洗涤5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。加终止液50μL，450nm波长测定各孔吸光度值。计算样品实际浓度。

2.7 HE染色和免疫组化 4%多聚甲醛固定24h后按常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，然后使用自动包埋机把组织包埋成蜡块。切片后常规二甲苯脱蜡，经各级浓度乙醇脱水，然后进行苏木素-伊红HE染色或者用柠檬酸盐缓冲液加入微波炉进行抗原修复，PBS洗3次，每次2min。滴加封闭液，37℃恒温箱30min。弃多余液体，不洗。滴加适当稀释的兔1gG（一抗）4℃过夜。PBS洗3次，每次2min。滴加二抗，37℃恒温箱30min。PBS洗3次，每次2min。DAB显色，镜下观察，适时终止。自来水充分冲洗返蓝5min。苏木素轻度复染，室温30s。自来水冲洗2min，80%，95%，100% ，100% Ⅱ的乙醇脱水各1min；二甲苯 Ⅰ 2min，二甲苯 Ⅱ 2min透明。中性树脂封片，检视。

2.8 统计学分析 使用SPSS 19.0进行统计分析，计量资料用均数加减标准差（x±s ）表示，采用单因素方差分析方法，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学有意义。

3 结果

3.1 大鼠烧烫伤创面恢复结果 不同剂量组油桐花水提物对大鼠烧伤创面恢复有明显效果，与模型组比较伤口直径明显减小。如图2所示。

3.2 Elisa检测 烧伤大鼠血清中Bcl-2、Bax表达情况见表1，与正常组比较，模型组血清中Bcl-2表达显著降低（P<0.01），中剂量组、低剂量组血清中Bcl-2表达显著升高（P<0.01），高剂量组与阳性对照组血清中Bcl-2表达无差异。与模型组比较，不同油桐花水提物剂量组及阳性对照组大鼠血清中Bcl-2表达水平显著上调（P<0.01）。

3.3 HE染色 模型组与正常组比较有大量纤维组织增生及炎性细胞浸润，皮下组织变性、坏死，模型制备成功。中剂量组和低剂量组基本无炎性细胞浸润，高剂量组和阳性对照组细胞轻度浸润。如图3所示。

3.4 免疫组化 与正常组比较，模型组促凋亡因子Bax表达水平显著升高。与模型组比较，油桐花水提物高、中、低剂量组促凋亡因子Bax表达水平下调。与模型组比较，油桐花水提物高、中、低剂量组抑凋亡因子Bcl-2表达水平上调。如图4、5所示。

4 讨论

烧伤是日常较为常见的意外伤害，一般因火焰烧伤、热接触伤、热液烫伤、电烧伤等造成严重炎症反应和疼痛，给人们的日常生活带来严重危害。中医药在治疗烧烫伤方面具有历史悠久、经验丰富的优势[10-11]。Bcl-2家族是细胞凋亡研究的一大热点，在细胞凋亡调控中发挥了重要作用。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最主要的抑制凋亡和促进凋亡蛋白[12]。Bcl-2/Bax比率是启动细胞凋亡的“分子开关”，细胞凋亡程度常用Bcl-2/Bax比率表示[13]。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bcl-2形成同源二聚体时抑制细胞凋亡[14-15]。试验及临床中常通过调节这两种蛋白表达来达到治疗的目的。油桐花为油桐（Vernicia fordii）所结的花，油桐又名桐子，为大戟科油桐属落叶小乔木，主要分布于四川、贵州、云南等省区[2，16]。油桐性味涩、微寒、有毒，归肺、心经，具有清热解毒，生肌的功效，油桐全株皆可入药，在民间有将其用于促进伤口愈合、消肿、镇痛、止血、消毒、麻醉等作用，油桐全身都是宝[4，16]，其开发利用价值，还需人们不断研究。

造模3天HE染色结果证明显示烧烫伤炎性浸润严重，造模成功。用药干预后HE染色结果证明，模型组大鼠皮肤组织内有大量炎性细胞浸润，烧伤大鼠模型制备成功，且油桐花水提物高、中、低剂量组皮肤组织内炎性细胞浸润有不程度的缓解，对烧伤有一定疗效。免疫组化检测结果表明，烧伤大鼠模型组皮肤组织中Bax表达较高、Bcl-2表达较低，而油桐花干预组大鼠皮肤组织中Bax表达较低、Bcl-2表达较高。由此可推测出，油桐花水提物可通过上调烧伤皮肤组织抑凋亡因子Bcl-2表达及下调烧伤皮肤组织促凋亡因子Bax表达，从而抑制细胞凋亡发生，促进烧伤创面愈合。Elisa检测结果说明，与正常组比较，模型组血清中Bcl-2表达显著降低。与模型组比较，不同油桐花水提物剂量组及阳性对照组均能显著上调大鼠血清中Bcl-2表达水平，增强皮肤组织抑制细胞凋亡作用。同时，在Elisa检測过程中，中剂量组和低剂量组Bax表达不稳定，不做统计；但其余4组表达是稳定可用的，正常组为（5.18±0.20）pg·mL-1、模型组为（3.75±0.09）pg·mL-1、阳性对照组为（6.03±0.57）pg·mL-1、高剂量组为（4.67±0.41）pg·mL-1，与模型组比较，正常组、高剂量组、阳性对照组血清中Bax表达有差异。油桐花水提物可以抑制烧伤大鼠血清中细胞凋亡，从而调节外周血中细胞凋亡，从而缓解大鼠烧烫伤。说明Bax、Bcl-2对烧烫伤形成与发展具有重要作用，油桐花水提物可通过上调烧烫伤大鼠中抑凋亡蛋白Bcl-2，从而调节Bcl-2/Bax比率，平衡Bax、Bcl-2含量，缓解烧烫伤病情。同时为后续进一步研究油桐花不同溶剂提取物，如醇提，乙酸乙酯提取、氯仿提取等，筛选出最佳干预烧烫伤溶剂提取物奠定一定实验基础。

综上，油桐花水提物可抑制烧伤大鼠细胞凋亡，恢复创面烧烫伤，与阳性药物烧烫伤膏作用相似，大鼠皮肤烧烫伤会导致皮肤组织中细胞凋亡升高。油桐花水提物可以通过抑制细胞凋亡，从而促进创面愈合，缓解烧烫伤病情。

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（收稿日期：2018-05-18 编辑：程鹏飞）