66份白三叶种质资源萌发期耐盐性综合评价

张志飞,武建新,曾宁波,穆 麟,张鹤山,文昭竹

(1.湖南农业大学农学院,湖南 长沙 410128; 2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,湖北 武汉 430064)

全球陆地6%的面积是盐渍土壤,表层土壤中过量的盐离子通过渗透胁迫、离子毒害和氧化胁迫等对植物造成伤害[1]。不同植物或同一植物的不同品种(或遗传资源)对盐胁迫的耐受能力差异较大,选用耐盐性植物(或品种)是对抗土壤盐渍化问题的有效途径。耐盐性品种选育、筛选时常用发芽期耐盐性鉴定对大批量品种(资源)进行初步评价,该方法可操作性强、周期短、效率高[2]。不同植物种子萌发过程中对NaCl浓度的耐受性差异较大。如孙璐等[3]以6个高粱(Sorghumvulgare)品种进行不同NaCl浓度梯度的发芽预备试验,结果发现,150 mmol·L-1NaCl胁迫下,高粱品种间各生长指标的差异最明显,由此确认150 mmol·L-1NaCl为高粱耐盐性鉴定的推荐浓度。龙卫华等[4]通过分析盐胁迫下甘蓝型油菜(Brassicanapus)的相对发芽率的变化趋势,最终确认214 mmol·L-1NaCl为鉴定油菜品系耐盐性的最适浓度。由此可见,适宜NaCl浓度胁迫的发芽试验可用于某一植物大批量材料的耐盐性评价。

白三叶(Trifoliumrepens)是豆科三叶草属多年生优良牧草,营养价值高,可放牧可刈割;同时还兼具园林绿化、护坡固土、肥土养地和生态修复等功能[5],但白三叶不耐盐,这一定程度上限制了其应用范围。NaCl浓度为0.4%(68.4 mmol·L-1)时,白三叶发芽势和发芽率均较清水对照极显著降低,幼苗和根的生长受到显著抑制;NaCl浓度超过0.4%,幼苗中游离脯氨酸、丙二醛和可溶性糖含量随着盐浓度的上升而增加[6];白三叶致死NaCl的临界阈值为300 mmol·L-1[7]。白三叶不同种质资源间耐盐性存在较大差异,如新疆三叶草NaCl溶液半致死浓度(50%发芽率)是0.6%(102.6 mmol·L-1),瑞文德和海法则依次是0.4%(68.4 mmol·L-1)和0.3%(51.3 mmol·L-1)[8]。尽管白三叶耐盐性生理生化特性[6-8]、耐盐机理[9]以及通过转基因[10]、接种益生菌[11]等提高耐盐性等方面取得了一定研究进展,但目前有关白三叶萌芽期耐盐性评价指标体系(NaCl胁迫的浓度,评价指标等)和大批量耐盐性材料评价的研究几乎未见报道。为此,对来源于俄罗斯的57份白三叶种质资源和9份国内外育成品种共66份材料进行NaCl盐胁迫发芽试验,通过预试验筛选适宜的盐胁迫浓度,然后通过主成分分析筛选耐盐性评价指标,并采用加权隶属函数法和系统聚类法对66份材料进行耐盐性排序分类,旨在建立快捷高效的耐盐性评价体系,筛选耐盐性强的材料,为白三叶的耐盐性育种和种植推广提供科学依据和理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

66份白三叶种子材料均由湖北省农科院畜牧兽医研究所提供,其中57份来源俄罗斯,9份是国内外育成的品种(表1)。

1.2 试验方法

各材料选取饱满、无病虫害的种子,用50%多菌灵可湿性粉剂500倍液浸泡种子20 min,蒸馏水洗净待用。为确定白三叶萌发期耐盐性评价适宜的NaCl浓度,前期以随机挑选的6个白三叶材料为对象,分别进行50、100、150、200、250 mmol·L-1NaCl胁迫的发芽试验,每重复50粒种子,4次重复,对照(CK)为去离子水。于人工气候箱进行20℃恒温培养(16 h/8 h,光照/黑暗),第10天结束试验。萌发和根系指标分析表明,NaCl浓度为50 mmol·L-1时,6份白三叶材料各指标间差异显著(P<0.05),超过50 mmol·L-1后,各材料不同观测指标均受到较明显抑制,指标间差异减小,因此最终确定50 mmol·L-1NaCl溶液用于评价66份白三叶材料萌发期的耐盐性。

参照国家牧草种子检验规程 发芽试验(GB/T 2930.4-2001),以50 mmol·L-1Na+溶液模拟盐胁迫条件进行滤纸法发芽试验,每重复50粒种子,4次重复,对照(CK)为去离子水。于人工气候箱进行20 ℃恒温培养(16 h/8 h,光照/黑暗),第10天结束试验。

1.3 观测指标

每隔24 h观察记录发芽种子数,以胚根或胚芽突破种皮长于种子长度为发芽标准,第4天计算发芽势(%),第10天计算发芽率(%),并计算发芽指数和活力指数(发芽指数×根长)[12]。试验结束时,每处理随机选取10株幼苗,用清水洗净,用LA-S系列植物根系分析软件(杭州万深检测科技有限公司)进行扫描分析,获得幼苗的主根长(mm)、苗长(mm)、根苗比(主根长/苗长)、根系表面积(mm2),根系体积(mm3),根系平均直径(mm)等性状指标的平均值。

1.4 数据处理与分析

运用DPS 7.05和SPSS 22分析软件进行数据处理与分析。

指标相对值=指标胁迫处理值/指标对照处理值×100%。

使用相关性分析和因子主成分分析方法对10项观测指标的相对值进行耐盐性评价指标筛选；采用模糊数学中隶属函数法[13]和系统聚类法对66份材料耐盐性进行综合评价。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对白三叶种子萌发与幼苗生长的影响

白三叶萌发期对照组的10项观测指标变异系数在8.94%～24.98%,说明66份参试白三叶材料的各指标性状本身存在着差异,且根系体积、根苗比和活力指数等指标在材料间差异较明显。盐胁迫组各指标变异系数值为12.45%～111.05%,可见66份参试材料在盐胁迫时各指标性状表现差异很大,其中活力指数、根系表面积和根系体积等指标差异最明显。盐胁迫组和对照组的10项观测指标基本统计数据表明:遭受盐胁迫时,除根系平均直径增加外,其他项指标均受到抑制(表2)。

表1 66份白三叶种质资源信息Table 1 Basic information for the 66 white clover germplasm resources

2.2 10项观测指标两两相关性分析

66份白三叶材料的相对发芽势、相对发芽率等10项测定指标相对值的两两相关性分析结果表明(表3),除相对发芽指数与相对苗长,相对根系平均直径与相对发芽率间没有显著相关(P>0.05)外,其他各指标间均存在极显著(P<0.01)或显著相关关系(P<0.05)。

表2 盐胁迫下66份白三叶材料10项观测指标的变化情况Table 2 Variation of 10 index values for the 66 white clover germplasm resources under salt stress

表3 盐胁迫下66份白三叶材料各指标间相关系数Table 3 Pearson correlation coefficients of indexes for the 66 white clover germplasm resources under salt stress

* 表示显著相关(P<0.05), **表示极显著相关(P<0.01)。RGP,相对发芽势;RGR,相对发芽率;RGI,相对发芽指数;RVI,相对活力指数;RTL,相对主根长;RSL,相对苗长;RTLSL,相对根苗长比;RRSA,相对根系表面积;RRV,相对根系体积;RRD,相对根系平均直径。下同。

* and ** indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 level, respectively. RGP, relative germination potential; RGR, relative germination rate; RGI, relative germination index; RVI, relative vigor index; RTL, relative taproot length; RSL, relative seedling length; RTLSL, relative ratio of taproot length to seedling length; RRSA, relative root surface area; RRV, relative root volume; RRD, relative root diameter; similarly for the following tables.

2.3 耐盐性评价指标筛选

对66份白三叶材料耐盐性评价试验的相对发芽势、相对发芽率等10项观测指标进行因子主成分分析(表4),前两个主成分的累积贡献率已达到81.9%,且特征值都大于1,表明前两个成分已经把材料81.9%的耐盐性信息反映了出来。根据主成分特征值大于1和累积方差贡献率大于80%的原则,选择前两个主成分作为66份白三叶材料耐盐性综合评价的主要因子。结合因子载荷矩阵(表5)可看出:第一主成分特征值为6.5,贡献率为64.8%,对应特征向量中载荷较大的4个指标是相对活力指数、相对根长、相对根系表面积和相对根系体积,分别为0.958、0.929、0.939和0.934,这些指标都与植株根系生长相关,因此可定义第一主成分为根系生长因子。根系生长因子中较大特征向量均为正值,说明白三叶的耐盐性与根系生长指标呈正相关关系,耐盐性越好的材料植株地下部生长越发达。第二主成分特征值为1.7,贡献率为17.0%,对应特征向量中载荷较大的3个指标为相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数,分别为0.702、0.660和0.588,这些指标都与种子萌发特性相关,因此可定义第二主成分为萌发特性因子。萌发特性因子中较大的特征向量均为正值,说明白三叶的耐盐性与发芽指标呈正相关关系,耐盐性越好的材料萌发特性越好。

表4 两个主成分的特征值以及贡献率Table 4 Special values and contributions of two principal components

表5 各因子载荷矩阵Table 5 Loading matrix of each component

综合指标相关性分析和主成分分析结果,在第一主成分根系生长因子中选择与其他根系指标存在极显著相关且特征向量最大的指标——相对活力指数,在第二主成分萌发特性因子中选择与其他指标存在极显著相关且特征向量最大的指标——相对发芽率,作为白三叶耐盐评价的指标对66份白三叶材料进行隶属函数耐盐性综合评价。

2.4 66份白三叶耐盐性隶属函数综合评价及聚类分析

相对活力指数和相对发芽率均为正向指标,因此用正向隶属函数公式计算各材料隶属函数值。再根据变异系数赋权公式计算两项指标的权重:相对活力指数的权重为0.849,相对发芽势权重为0.151。最后,利用综合隶属函数公式计算出66份白三叶材料萌发期的耐盐综合隶属函数值(D值)(表6)。将66份白三叶材料的耐盐综合隶属函数值采用欧氏距离平均连锁法进行聚类分析(图1),在欧式距离5处可将参试材料分为3个类群:第1类群包括编号为9、50、51等10份种质材料,该类群耐盐综合隶属函数值均较高(D>0.66),耐盐性强。值得注意的是第1类群下有两个亚类群,其中隶属函数值排列前三的9、50、51归为一亚类,耐盐综合隶属函数值(D>0.90),排名前3;剩余的7份材料为一亚类。第2类群包括编号为31、41、55等10份种质材料,耐盐性居中;第3类群包括编号为35、38、40等46份种质材料,综合隶属函数值D<0.30,属于耐盐性弱的类群。

分别挑选耐盐综合隶属函数值排名前3位和后3位以及居中的3个材料进行比较(图2),可以明显看出,不同耐盐级别的代表性材料的根系伸长状况差异明显,耐盐性强的材料植株根系生长受抑制作用小,且有真叶长出;耐盐性弱的材料在盐胁迫下生长受到严重影响,植株矮小、根短且根尖明显受损,子叶叶片小。

3 讨论与结论

3.1 种质资源耐盐性评价指标的选择

种子萌发期是植物对外部环境较敏感的时期,萌发期抗逆性可直接反映植物出苗和后续生长状况,因此前人多以植物萌发期作为评价种质资源耐盐性的重要生育时期[3-8,14-20]。耐盐性种质资源评价时,评价指标存在较大差异。孙璐等[3]通过两两相关性分析和主成分分析确定高粱(S.bicolor)耐盐性筛选指标是根长、叶重和发芽率,并将42个高粱品种分为高度耐盐、耐盐、中等耐盐、盐敏感以及高度盐敏感5个类型。于洁等[15]采用灰色关联分析对10 份苜蓿属(Medicago)植物萌发期的耐盐性指标进行筛选,最后确定发芽率和幼苗干重,作为鉴定供试材料耐盐性指标。孟祥浩等[16]选用发芽率、发芽势、胚芽鞘长、根长、苗高、第 1 片叶的生长速度以及苗鲜质量等指标作为冬小麦(Triticumaestivum)萌发期耐盐性筛选指标,从11个冬小麦品种中筛选出两个耐盐能力强的品种。宫文龙等[17]通过测定发芽势、发芽率、芽长及根长从22个苜蓿品种中筛选出三得利、新牧1号和生存者等3个耐盐性最强的品种。陈新等[18]以发芽势、发芽率、根长、苗高4个鉴定指标的耐盐系数进行加权隶属函数综合评价278份裸燕麦(Avenasativa)种质的耐盐性。

表6 66份白三叶种质资源耐盐隶属函数排序Table 6 Ranking of salt tolerant subordinate function values for the 66 white clover germplasm resources

图1 66份白三叶材料耐盐性聚类Fig. 1 Dendrogram of salt tolerance for the 66 white clover germplasm resources

图2 不同耐盐水平代表材料的植株形态对比Fig. 2 Comparison of representative material appearance with different salt tolerance

本研究通过指标相关性分析和因子主成分分析从萌发指标、根系指标等10项指标中筛选出相对活力指数和相对发芽率两项指标作为白三叶萌发期耐盐性评价指标,并根据变异系数赋权计算各指标权重。筛选出的指标与前人的评价指标具有较高一致性:发芽率、发芽势和根长普遍被接受为萌发期耐盐性评价的重要指标[15-19],本研究活力指数基于萌发指数×根长,主成分分析时,相对活力指数、相对根长、相对根系表面积和相对根系体积都属于第一主成分,对应特征向量中载荷较大,根据两两相关性,选择了相对活力指数。发芽率、发芽指数、根长的测定方法简单,而且通过相关性分析和因子主成分分析将复杂的多指标去重复、简单化,通过指标的权重既能全面反映白三叶的耐盐性信息,又能客观区分指标的重要性,是一套用于评价白三叶种质资源耐盐性的较为科学、系统、快捷的方法,可应用于白三叶苗期耐盐性种质资源鉴定和筛选。

3.2 白三叶的耐盐性

一定浓度范围的Na+通过渗透效应和离子效应抑制植物种子萌发[20-21],NaCl胁迫造成白三叶细胞膜系统的损伤,且胁迫强度越大细胞膜受损越大;同时过量的Na+还会影响白三叶叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量、超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性等指标,最终造成白三叶的存活率和相对株高呈显著下降趋势[2,22]。本研究亦发现白三叶在受盐胁迫后种子萌发性能和根系生长均受到不同程度的抑制,参试的66份白三叶材料耐盐性分为强、中、弱3个级别,耐盐性强的材料受盐胁迫的伤害轻,反之则重,其中耐盐性较好的白三叶种质材料有10份:CF022540、CF022469、CF022538、CF022541、惠亚、ZXY06P-2659、CF022543、CF022470、CF022508及CF022466。除惠亚是新西兰育成品种外,其余9份材料都是来自俄罗斯的野生种质资源,这说明野生资源中有大量的耐盐资源,未来应加大对野生白三叶种质资源的搜集和挖掘,为耐盐白三叶选育和耐盐品种推广提供材料。