6-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗生长及生理特性的影响

何丽娟，祁 娟，马红萍，吴召林，金 鑫，孙守江,刘文辉

(1.甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室,甘肃省草业工程实验室,中-美草地畜牧业可持续研究中心,甘肃 兰州 730070; 2.青海省畜牧兽医科学院 青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室,青海 西宁 810016)

土壤盐渍化是世界性的资源和生态环境问题，全球的土地遭受盐渍化侵害严重，中国约有1/4的耕地面积已发生盐渍化，严重制约了农作物的生长发育[1]。植物在盐离子胁迫下，内部渗透调节系统失衡，质膜透性增加，细胞膜结构损伤，活性氧大量累积；高盐甚至会使植物减产，严重时导致死亡[2-3]。因此，植物抗盐性及调控措施的研究对盐碱地的改良及利用具有重要的意义。研究发现，盐胁迫下外源物质能够缓解植物种子受到的伤害，如适当浓度的外源CaCl2对高羊茅(Festucaelata)种子进行浸种处理，能缓解盐胁迫伤害，还可促使种子提前萌发[4]；黄瓜(Cucumissativus)和黄芪(Astragalusmembranaceus)种子在盐胁迫下经水杨酸(SA)处理，发芽率、发芽速度、发芽指数等均提高[5-6]。本研究使用的外源物质6-BA(6-苄基腺嘌呤)是一种人工合成的细胞分裂素类化合物，可以促进细胞分裂、诱导芽分化、还可调控营养物质在植物体内的运输、促进新陈代谢[7]，且有利于植物在逆境条件下进行光合作用[8]，维持细胞膜的稳定性，缓解多种逆境对植物种子的萌发和幼苗生长的胁迫[9]。6-BA对盐胁迫下大豆(Glycinemax)幼苗生理指标，草莓(Fragaria×ananassa)试管苗酶活性的研究均发现，6-BA能够刺激植物体内渗透调节物质的大量产生，降低活性氧的积累，从而减轻逆境对植物造成的伤害，提高植物抵抗外界逆境的能力[10]。在番茄(Lycopersiconesculentum)上的研究表明，适当浓度的6-BA能够缓解盐胁迫下种子的萌发，幼苗的生长发育[11]。在苦马豆(Sphaerophysasalsula)、小麦(Triticumaestivum)的研究上发现，6-BA促进了植物的生长，主要是通过加强酶的活性来适应盐胁迫逆境，从而提高抗盐性[12-13]。

老芒麦(Elymussibiricus)是禾本科披碱草属多年生疏丛型中旱生植物，营养价值较高，抗逆境能力强，抗寒性好，适口性较好，牲畜喜食，容易栽培[14]。老芒麦在栽培草地建设、草地退化改良、水土保持、生态建设以及景观效果等方面发挥着重要作用。关于老芒麦抗旱抗寒方面已有大量报道，在土壤遭受干旱盐渍化日趋严重的今天，如何更好地挖掘老芒麦的利用潜力，采取有效措施改良土地盐碱化是仍是目前面临的主要瓶颈问题。外源激素对盐胁迫下花卉、作物[10-11]等的研究报道较多，而在老芒麦上的研究鲜见报道。为此，本研究以野生老芒麦为材料，旨在研究6-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗形态特征、膜质过氧化物，渗透调节物质的影响，为实践生产中的利用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为2015年采自甘肃天祝县高寒草地的野生老芒麦种子。采样地海拔3 300 m；年均温-0.1 ℃，>0 ℃年积温1 380 ℃·d；年均降水量416 mm，年均日照时间2 600 h，水热同期；年均蒸发量1 592 mm，没有绝对无霜期。

1.2 试验方法与设计

幼苗培养：试验于2017年3月在甘肃农业大学草业学院组培室进行。将粗砂过筛，经自来水冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗2～3次，先经121 ℃灭菌，再经150 ℃高温烘干。选取大小一致、饱满且无病虫害的老芒麦种子，每杯50粒，将其均匀撒在一次性口杯中，覆盖一层浅沙，移至组培室，通风透光，每天浇灌适量蒸馏水。待苗长至2～3 cm左右，换用Hoagland营养液[15]，每5 d换一次，每次换营养液之前用蒸馏水冲洗以防止盐分积累。每天观察记录幼苗的生长情况。

试验设计：参考小麦、水稻(Oryzasativa)、羊草(Leymuschinensis)等植物的研究结果，设置5个NaCl盐胁迫浓度(0、50、100、150、250 mmol·L-1)和5个6-BA浓度(0、5、10、20、30 mg·L-1)交互作用，共25个处理，每处理3次重复。待幼苗长至三叶期将不同浓度的NaCl溶液(以 Hoagland营养液为溶剂配制)浇至培养盆中，每5杯放一个塑料培养盒，每盒500 mL划线记号，每天浇入等量的蒸馏水，每3 d处理一次，处理期为7 d。盐胁迫处理后用不同浓度(以 Hoagland营养液为溶剂配制)的6-BA溶液处理，每盒500 mL，之后每天浇入等量的蒸馏水，每3 d处理一次，处理期为10 d。

1.3 试验指标测定

形态指标：随机取相同处理3个重复中的10株老芒麦植株测定株高，从根茎基部至离生长点最近的展开叶顶端的绝对高度；用刻度尺测量从根基部数起，倒数第二叶的长度和宽度；

叶面积=叶长×叶宽×0.75[16]。

生理指标：随机取相同处理的10株老芒麦植株对相同叶片的相同部位用叶绿素含量测定仪(SPAD-502 Plus，浙江托普仪器有限公司)进行叶绿素含量测定；游离脯氨酸采用酸性茚三酮法测定[17]；丙二醛采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定[17]；可溶性糖采用蒽酮法测定[17]；可溶性蛋白含采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[17]。以上各处理其指标均为3次重复。

1.4 数据处理

各指标与抗性呈正相关关系时隶属函数:

F=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

呈负相关关系时：

F=1-[(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)]。

式中：F表示测定指标的具体隶属函数；Xj表示某个指标的测定值；Xmin表示某一指标所有测定值中的最小值；Xmax表示最大值；然后将相同处理下各个指标所得值进行平均，所求即为最终的隶属度值[18]。

用SPSS 20.0软件对幼苗形态指标、生理指标试验数据进行方差分析和显著性比较，再利用Microsoft Excel 2010进行综合处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度盐胁迫下6-BA处理对老芒麦幼苗农艺性状的影响

仅NaCl胁迫下，老芒麦幼苗株高在250 mmol·L-1NaCl胁迫下相比无盐处理减少了57.4%倍(图1)。100 mmol·L-1NaCl胁迫下，随6-BA浓度升高株高均低于无6-BA处理，缓解效果不明显；150 mmol·L-1NaCl胁迫下，5 mg·L-16-BA处理与无6-BA处理差异显著(P<0.05)，降低了15.2%；250 mmol·L-1时，20 mg·L-16-BA处理显著高于无6-BA处理(P<0.05)，增长了27.0%。盐浓度越高，6-BA处理缓解效果越明显，20 mg·L-16-BA处理下，250 mmol·L-1NaCl胁迫较0、5、30 mg·L-1的6-BA处理差异显著(P<0.05)。

盐胁迫显著抑制了老芒麦幼苗叶的生长，随着盐浓度的升高，叶受到的伤害越严重，仅NaCl胁迫下，250 mmol·L-1NaCl胁迫幼苗叶长明显降低(图1)，相比无盐处理减少了61.7%。无盐胁迫下， 30 mg·L-16-BA处理相比无盐处理增长了11.6%(P<0.05)。50 mmol·L-1NaCl胁迫下30 mg·L-16-BA处理显著低于无6-BA处理的(P<0.05)；150 mmol·L-1盐胁迫下，5 mg·L-16-BA处理较无6-BA处理的减少了15.1% (P<0.05)；100、250 mmol·L-1盐胁迫下6-BA各处理间差异不显著(P>0.05)。

盐胁迫浓度越高，老芒麦叶受到的抑制作用越严重，仅NaCl胁迫下，叶宽在50、100 mmol·L-1NaCl胁迫处理下相比无盐处理减少了16%、9.4%(图1)。无盐胁迫下，30 mg·L-16-BA处理相比无6-BA处理增加了15.4%(P<0.05)。50、100 mmol·L-1NaCl胁迫下，6-BA各处理间差异不显著(P>0.05)；150、250 mmol·L-1盐胁迫下,高浓度6-BA在一定程度上缓解了盐胁迫造成的伤害，但是效果不明显。

仅NaCl胁迫下，老芒麦幼苗叶面积在150、250 mmol·L-1NaCl胁迫下降低量明显，相比对照分别减少了29.0%、44.8%(图1)。无盐胁迫下，30 mg·L-16-BA处理显著高于无6-BA处理(P<0.05)，增长了26.6%。100 mmol·L-1盐胁迫下，6-BA各处理间差异不显著(P>0.05)；150 mmol·L-1盐胁迫下，5、30 mg·L-16-BA处理显著低于无6-BA处理 (P<0.05)。

2.2 6-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗生理特性的影响

2.2.16-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗叶绿素SPAD值的影响 仅NaCl胁迫下，相比无盐处理，250 mmol·L-1盐胁迫下老芒麦叶绿素SPAD值减少了30.6%(图2)，可见盐胁迫处理造成了其叶绿体色素的降解。添加6-BA处理后，盐胁迫得到了一定程度的缓解，且随其浓度的增加，缓解效果增强。250 mmol·L-1NaCl胁迫下，10和20 mg·L-16-BA处理相比无6-BA处理增加了18.2%(P<0.05)和17.3%(P<0.05)；100 mmol·L-1NaCl胁迫下，6-BA各处理间差异不明显。相同6-BA处理下，低盐胁迫对植株伤害较轻，高盐胁迫伤害严重。如30 mg·L-16-BA下，250 mmol·L-1NaCl胁迫相比其他6-BA处理的叶绿素低。

图1 6-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗农艺性状的影响Fig. 1 Effect of 6-BA on the agronomic traits of Elymus sibiricus seedlings under salt stress

不同小写字母表示相同盐浓度胁迫下不同6-BA浓度处理间差异显著(P<0.05)。CK为未进行处理。

Different lowercase letters indicate significant differences among different 6-BA treatments with in the same salt concentration at the 0.05 level; similarly for the following figures.

图2 6-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗叶绿素含量的影响Fig.2 Effect of 6-BA on chlorophyll content SPAD value of Elymus sibiricus seedlings under salt stress

图3 6-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗丙二醛含量的影响Fig. 3 Effect of 6-BA on malondialdehyde(MDA) content of Elymus sibiricus seedlings under salt stress

2.2.26-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗丙二醛含量的影响 仅NaCl胁迫下，≤150 mmol·L-1NaCl胁迫下，老芒麦体内积累了少量的丙二醛(MDA)， 250 mmol·L-1NaCl胁迫下相比无盐处理增加了7.6%(图3)。可见盐浓度越高，积累的MDA越多。无盐胁迫下，10 mg·L-16-BA 处理相比无6-BA处理显著减少了64.9%(P<0.05)。150 mmol·L-1NaCl胁迫下，5、10 mg·L-16-BA处理显著低于无6-BA处理(P<0.05)，分别减少了26.8%和42.2%；250 mmol·L-1NaCl胁迫，10 mg·L-16-BA处理MDA含量最低，相比无6-BA处理减少了50.0%。

2.2.36-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗游离脯氨酸含量 仅NaCl胁迫下，随盐浓度增加，老芒麦幼苗游离脯氨酸含量逐渐增加，各浓度处理间差异不明显。无盐胁迫下，30 mg·L-16-BA处理相比无6-BA处理增加了5.7倍(P<0.05)(图4)。50、100、150mmol·L-1NaCl胁迫下，6-BA各浓度处理间差异显著(P<0.05)；150 mmol·L-1NaCl胁迫下，20 mg·L-16-BA处理较对照增加了6.3倍。表明老芒麦幼苗体内的脯氨酸含量随着NaCl浓度的增加而增加，高盐处理下其含量更高，外施6-BA处理后相比盐胁迫处理其含量进一步增加，250 mmol·L-1处理样品缺失，无游离脯氨酸含量数据。

2.2.46-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗可溶性糖含量的影响 仅NaCl胁迫下，250 mmol·L-1NaCl胁迫下，可溶性糖含量相比对照增加了一倍，明显高于其他浓度NaCl胁迫(图5)。6-BA处理下，≥100 mmol·L-1NaCl胁迫下，20、30 mg·L-16-BA处理相比无6-BA处理可溶性糖含量显著增加(P<0.05)。

2.2.56-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗可溶性蛋白含量的影响 可溶性蛋白含量在50、100、150 mmol·L-1NaCl胁迫下，各处理间差异不显著(P>0.05)(图6)。无盐胁迫下，可溶性蛋白含量在30 mg·L-16-BA处理时最高，较无6-BA处理增加了98.1%。250 mmol·L-1NaCl胁迫下，6-BA各处理间可溶性蛋白含量差异明显，30 mg·L-16-BA处理可溶性蛋白含量最高，显著高于5和20mg·L-16-BA处理的。

2.3 6-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗生长特性的隶属函数综合分析

随着盐胁迫浓度的增大，隶属函数值总体逐渐减小(表1)，20 mg·L-16-BA处理下，150 mmol·L-1盐胁迫隶属函数值较高；30mg·L-16-BA处理下，100mmol·L-1盐胁迫隶属函数值较高。综合来看，6-BA处理下，100 mmol·L-1盐胁迫对植物伤害较小。无盐胁迫下，随6-BA浓度增加，隶属函数值逐渐增高。 50、150、250mmol·L-1盐胁迫下，20 mg·L-16-BA处理后隶属函数值较高；100 mmol·L-1盐胁迫下，30 mg·L-16-BA处理后隶属函数值较高。

图4 6-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗游离脯氨酸含量Fig. 4 Effect of 6-BA on free proline content of Elymus sibiricus seedlings under salt stress

图5 6-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗可溶性糖含量的影响Fig. 5 Effect of 6-BA on soluble sugar content of Elymus sibiricus seedlings under salt stress

图6 6-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗可溶性蛋白含量的影响Fig. 6 Effect of 6-BA on soluble protein content of Elymus sibiricus seedlings under salt stress

6-BA浓度 6-BA centration/(mg·L-1)盐浓度 Salt concentration/(mmol·L-1)050100150250隶属度值Subordinate values排序Rank00.5250.4550.4220.3700.2260.400450.5420.4280.4300.3520.2160.3945100.5930.4020.4480.4520.3780.4553200.7320.5290.4430.5580.4110.5341300.7970.3900.5270.4930.2420.4902隶属度值Subordinate values0.6380.4410.4540.4450.295排序Rank 14235

3 讨论

3.1 盐胁迫对老芒麦幼苗生长及生理特性的影响

盐胁迫抑制了植物的形态指标(如地上和地下生物量等)和种子发芽率，随着盐浓度增加，抑制作用越严重[19-20]。本研究发现，老芒麦幼苗地上部的各形态指标在250 mmol·L-1NaCl胁迫下明显减少，尤以株高减少明显，表明盐胁迫抑制了老芒麦幼苗的生长，这与杨升等[21]在沙枣(Elaeagnusangustifolia)幼苗上的研究结果一致。盐胁迫下植物体叶绿素SPAD值逐渐减少，尤以250 mmol·L-1NaCl胁迫降低明显著，孙璐等[22]也发现高粱(Sorghumbicolor)在高盐胁迫下叶绿素含量减少，本研究250 mmol·L-1NaCl胁迫叶绿素SPAD值较对照降低了30.6%。MDA是膜质氧化过程中的一种有害产物，其大量积累会直接影响细胞膜功能[23]，<200 mmol·L-1NaCl胁迫下小麦[24]和油菜(Brassicanapus)[25]叶片中MDA含量积累不明显， 200 mmol·L-1NaCl胁迫下MDA含量积累显著(P<0.05)。本研究中老芒麦在<200 mmol·L-1NaCl胁迫后MDA含量积累不明显，而250 mmol·L-1NaCl胁迫下MDA含量增加了7.6%，可见高盐胁迫下植物体内积累的MDA含量增多。脯氨酸水溶性很高，并以游离状态存在，盐胁迫下，脯氨酸含量迅速上升[26]，本研究中150 mmol·L-1NaCl胁迫下相比无盐处理游离脯氨酸含量增加明显。植物体内的可溶性糖在盐胁迫等逆境下既是渗透调节剂，又是植物体内其他有机质合成的碳架和能量来源[27]，盐胁迫下植物体内的蛋白酶活性升高，导致蛋白质大量水解减少[28]。程红岩等[29]对松塔景天(Sedumsediforme)进行了研究，发现随着盐胁迫浓度的增加，可溶性糖、可溶性蛋白逐渐增多，而可溶性糖在低浓度下增加量不明显，高浓度增加量显著(P<0.05)，这与本研究结果相一致。无6-BA处理下250 mmol·L-1NaCl胁迫，可溶性糖含量增加了一倍，而宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)[30]在相同盐浓度下含量也明显增加。

3.2 6-BA处理对老芒麦幼苗生长及生理特性的影响

外源物质6-苄基腺嘌呤(6-BA)是通过增加植物体内的细胞分裂素来缓解盐胁迫对植物的伤害，从而促进植物的生长，主要能够促进植物地上和地下部分生物量的增加[31]。清除盐胁迫下植物体内的自由基，减少活性氧、膜质氧化物的积累，刺激渗透调节物的大量产生[32]。本研究盐胁迫下，老芒麦幼苗各项被抑制的生长指标在6-BA处理下均得到了不同程度的缓解。在0、150、250 mmol·L-1NaCl处理下，MDA含量在10 mg·L-16-BA处理较无6-BA处理显著(P<0.05)减少了64.9%、42.2%和50.0%；而6-BA对盐胁迫下大豆幼苗[10]的试验发现，MDA减少量没有老芒麦的显著(P<0.05)，可见适宜浓度6-BA能够缓解盐胁迫对老芒麦造成的伤害，进一步保护细胞膜系统。对苦马豆[12]苗期的研究发现盐胁迫下6-BA处理游离脯氨酸含量相比仅盐胁迫增加了，其主要是外源物质促进了有关脯氨酸合成酶的活性。本研究在盐胁迫下，6-BA处理增加了老芒麦体内的游离脯氨酸含量，无盐胁迫下，尤以30 mg·L-16-BA处理游离脯氨酸含量的增幅显著(P<0.05)，较无6-BA处理增加了5.7倍，100、150 mmol·L-1NaCl胁迫下，6-BA各处理增加量显著(P<0.05)，而在苦马豆[12]、番茄[11]上的处理促进效果不明显，表明6-BA在老芒麦上的促进效果较好。无盐胁迫下，老芒麦可溶性蛋白含量在30 mg·L-16-BA处理较无6-BA处理增加了98.1%；覃杰明等[33]对铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)研究发现，20 mg·L-16-BA处理，促进了幼苗根的生长率，可溶性糖含量增加量少。本研究中100 mmol·L-1NaCl胁迫下，20 mg·L-16-BA处理可溶性糖较无6-BA处理增加了1.7倍(P<0.05)，表明6-BA处理能够促进盐胁迫下老芒麦体内可溶性糖含量的上升，维持细胞渗透环境。老芒麦在盐胁迫下经6-BA处理各项抗性指标较理想，可以考虑在盐碱化土地的改良和生产实践中应用。

3.3 6-BA对盐胁迫下老芒麦幼苗生长及生理特性的隶属函数综合评价

隶属函数评判法可以较准确地反映植物的抗逆性特征[34]。本研究使用隶属函数法综合分析发现，在未进行6-BA或相同6-BA处理下，随着盐胁迫浓度的不断增大，隶属函数值逐渐减小，30 mg·L-16-BA处理下，100 mmol·L-1NaCl胁迫隶属函数值较高，可见高浓度6-BA处理下，老芒麦各指标的隶属函数值均较理想。综合发现6-BA处理下，100 mmol·L-1NaCl胁迫对植物伤害较小。无盐胁迫下，随着6-BA浓度增加，隶属函数值逐渐增高。50和150 mmol·L-1NaCl胁迫处理，均以20 mg·L-16-BA处理隶属函数值较大。雷雄等[35]研究也发现20 mg·L-16-BA处理缓解垂穗披碱草(Elymusnutans)遭受的胁迫，且效果最为理想，10～30 mg·L-16-BA处理均可促进和改善其种子萌发和幼苗生长状况。

4 结论

盐胁迫抑制了老芒麦幼苗的生长，随其浓度增加，植株地上部的各形态指标和叶绿素SPAD值均下降，250 mmol·L-1盐胁迫下，株高明显降低；可溶性糖较无6-BA处理增加了一倍。无盐胁迫下，随6-BA浓度的增大促生效果越明显，30 mg·L-16-BA处理下可溶性蛋白和游离脯氨酸含量较无6-BA处理分别增加了98.1%、5.7倍，MDA含量在10 mg·L-16-BA处理下较无6-BA处理减少了64.9%；同一盐胁迫下，随6-BA浓度增大缓解盐胁迫效果增强；相同6-BA处理下，高盐胁迫被缓解效果显著(P<0.05)； 250 mmol·L-1盐胁迫下，叶绿素含量在20 mg·L-16-BA处理较无6-BA处理增加了17.3%，100 mmol·L-1盐胁迫下，可溶性糖在20 mg·L-16-BA处理下较无6-BA处理提高了1.7倍。经隶属函数综合分析，盐胁迫下，20 mg·L-16-BA处理缓解效果较好；6-BA处理下，100 mmol·L-1盐胁迫对老芒麦伤害较轻。