云南松松针药材质量标准研究

张志琴 郭向群 聂奇华

【摘 要】 目的：制定松针药材的质量标准，为药用植物资源开发利用提供科学依据。方法：浸出物测定法，灰分测定法，水分测定法，薄层色谱法及高效液相色谱法。结果：对不同产地及收集时间云南松松针的浸出物、总灰分、酸不溶性灰分和水分进行了测定；同时对其活性成分山柰酚进行了薄层定性鉴别和高效液相色谱法定量研究。结论：通过研究制定了松针药材的质量控制标准。

【关键词】 松针；质量标准；山柰酚；薄层色谱法；高效液相色谱法

【中图分类号】R284 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）09-0010-04

Abstract：Objective To provide scientific basis for the utilization and development of Pine needle. Method The extract of pine needle was examined Moisture and ash were determined. And the active component were analyzed by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography. Results Content of total ash， acid insoluble ash， and moisture of pinus yunnanensis from different areas and times were determined. The qualitative and quantitative analysis of kaempferol by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography were performed respective. Conclusion The established method can be used for the quality specification of Pine needle.

Keywords：Pine needle； Quality specification； Kaempferol； Thin layer chroma- tography； HPLC

松針（pine needle），别名猪鬃松毛、松毛、山松须，为松科松属植物的针状叶。松针是我国传统中药，在历代本草中均有记载。《别录》谓其：“主风湿疮，生毛发，安五脏”。《本草纲目》记载：“松针，气味苦、温、无毒，久服令人不老，轻身益气，主风湿疮，生毛发，安五脏，守中，不饥延年”[1]。现代研究表明，松针具有镇痛、抗炎、镇咳、祛痰、抗突变、降血脂、降血压、抑菌等作用，其利用价值日益受到关注[2-4]。据文献报道，松针中含有山柰酚等黄酮类成分[5]，山柰酚在防癌、抗癌、抗感染、抗炎及免疫抑制等方面有重要作用[6]。另外，山柰酚还能够降低血糖，改善胰岛素抵抗[7]。本研究对云南松松针中所含该活性成分采用TLC及HPLC进行了定性、定量研究，并对药材的水分、灰分、浸出物进行了测定，为制定松针的质量控制标准、开发新药奠定了基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津）；Sartorius BS 224S万分之一分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司）；SX2-4-10箱式电阻炉（上海-恒科学仪器有限公司）；索氏提取器；As10200型超声波清洗机（北京华博科技制造有限公司）；DZKW-4电子恒温水浴锅（上海科析试验仪器厂）。

1.2 材料 硅胶G预制薄层板（批号20141006，青岛海洋化工厂，100mm×100mm）；HPLC级乙腈（德国MERCK公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯；山柰酚对照品（批号MUST-13121112，成都曼思特生物科技有限公司）。松针药材9批，分别产自楚雄（2批）、南华、永仁、牟定、大姚、禄劝、大理、巍山。经楚雄医药高等专科学校生药教研室姚荣林教授鉴定为云南松（Pinus yunnanensis Franch）松针。

2 方法及结果

2.1 水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物的测定

2.1.1 测定方法[8] 水分测定参照2015年版《中华人民共和国药典》四部0832项下水分测定法中第二法（烘干法）；总灰分、酸不溶性灰分测定参照2302项下灰分测定法；浸出物测定参照2201项下浸出物测定法，以乙醇为溶剂，采用热浸法测定醇溶性浸出物。

2.1.2 测定结果 9批样品的水分、总灰分和酸不溶性灰分、浸出物的测定结果见表1。9批云南松松针药材水分的平均含量为11.25%，总灰分的平均含量为3.28%，酸不溶性灰分的平均含量为0.27%，醇溶性浸出物的平均含量为20.83%。依照《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求，按其平均值的±20%作为限度的制定幅度，暂定云南松松针药材水分含量不得超过13.50%，总灰分不得超过3.94%，酸不溶性灰分不得超过0.32%，醇溶性浸出物不得少于16.66%。

2.2 松针的薄层色谱（TLC）鉴别 取云南松松针粉末2g，加甲醇-20%盐酸（4∶1）混合溶液50 mL，回流提取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取山柰酚对照品，加甲醇制成1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝显色，在紫外灯（365 nm）下检识，山柰酚荧光斑点清晰，分离效果理想。薄层色谱图如图1所示。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：InertSustainC18（250mm×4.6mm， 5μm）；流动相：乙腈∶0.3%磷酸水溶液（30∶70）；流速：1 mL/min；柱温：40℃；检测波长：365 nm，进样量：10 μL。色谱柱的理论板数按山柰酚计算应不低于6000，分离度大于1.5。如图2所示。

2.3.2 对照品溶液制备 取山柰酚对照品9 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加流动相甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，使成为0.9602 mg/mL的对照品储备液。

2.3.3 供试品溶液的制备 称取云南松松针粉末（4号筛）约1.0 g，精密称定，各加入甲醇-20%盐酸（4∶1）混合溶液25 mL，加热回流提取2次，每次1.5 h，合并滤液并定容至50 mL量瓶中，用0.45 μm滤膜过滤，备用[9]。

2.3.4 线性关系考察 精密量取对照品储备液1.0 mL置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，配成0.09602mg/mL的对照品；分别精密吸取上述对照品溶液2、4、6、8、10 μL按上述色谱條件依次进样，以山柰酚进样量（μg）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=5×106X-9184.3，r=0.9998，山柰酚在0.19～0.96 μg范围内成良好的线性关系。如图2所示。

2.3.5 精密度试验 精密吸取山柰酚对照品溶液（0.09602mg/mL）10 μL，按上述色谱条件连续进样5次，记录山柰酚色谱峰峰面积RSD为0.84%，显示具有良好的精密度。

2.3.6 重复性试验 按“2.3.3”项下操作，处理同一样品5份，精密吸取10μL进样检测，记录山柰酚的峰面积，计算RSD为1.21%（n=5），表明实验方法的重复性较好。

2.3.7 稳定性试验 取同一份供试液，在“2.3.1”项色谱条件下，于0、4、8、12、16 h分别记录山柰酚峰面积，计算峰面积的RSD值为1.01%，表明供试液在16 h内稳定。

2.3.8 加样回收率试验 采用加样回收法，精密称取已知含量的药材适量，分别精密加入一定量的山柰酚对照品，按供试品制备与测定方法，在上述色谱条件下，平行做5组，结果测得其平均回收率为101.04%，RSD为1.02%。

2.3.9 样品测定 依上述方法，测定9批松针药材中山柰酚含量。结果见表1。色谱图如图3所示，图中1为山柰酚。

3 讨论

3.1 样品处理条件的确定 本研究考察了甲醇-10%盐酸（4∶1）、甲醇-20%盐酸（4∶1）和甲醇-30%盐酸（4∶1）3种水解溶剂。结果表明以甲醇-20%盐酸（4∶1）混合液作为水解溶剂时所得样品含量最高，故确定采用甲醇-20%盐酸（4∶1）混合液为水解溶剂。又以甲醇-20%盐酸（4∶1）混合液为溶剂，比较了回流和超声方法对提取率的影响，结果回流提取率明显高于超声。同时还进一步比较了不同提取时间和次数对提取效果的影响，最终确定提取2次，每次1.5 h基本能够提取完全。

3.2 薄层条件的确定 通过比较多种展开系统苯-乙酸乙酯-乙酸、环己烷-乙酸乙酯-甲酸、甲苯-乙酸乙酯-甲酸、环己烷-三氯甲烷-丙酮等，结果表明环己烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶5∶1）作为展开剂斑点清晰、分离度好。考察了三种不同品牌的薄层板：硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）、硅胶G薄层板（青岛美高集团有限公司）、自制硅胶G薄层板，均可对松针中山柰酚成分进行定性鉴别。按照试验所得薄层色谱条件，考察本品在温度15～29℃、相对湿度为40%～70%展开时，对薄层色谱结果的影响。结果表明，在上述温度、相对湿度范围内对该薄层色谱结果无明显影响，9批不同产地的松针样品均可检出山柰酚，斑点清晰且方法简便、快速、可行，此方法可用作松针药材的定性鉴别。

3.3 色谱条件优化 考察了2种色谱柱，InertSustainC18（250mm×4.6mm， 5μm）和Phenomenex Gemini-NX C18（250mm×4.6mm， 5μm）色谱柱，结果显示，后者所得山柰酚峰和杂质峰分离效果较差，峰形展宽，而前者分离效果较好，故选择InertSustainC18（250mm×4.6mm， 5μm）色谱柱。对不同流动相系统（甲醇-水、乙腈-1%冰醋酸、乙腈-0.3%磷酸、甲醇-0.3%磷酸水溶液），结果显示以乙腈-0.3%磷酸水溶液（30∶70）的分离效果较好，所得峰形及峰纯度最好。考察了不同流速（0.8、0.9、1.0mL/min）、不同柱温（25、30、40℃），确定最佳流速为1mL/min，柱温40℃。在上述条件下测得山柰酚相对标准偏差、分离度均符合定量测定要求。

本实验首次比较全面建立了云南松松针药材水分、灰分、浸出物检查，薄层色谱鉴别以及药材含量测定方法，且方法简便、准确、灵敏度高，为松针药材的质量控制提供了科学依据。

参考文献

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（收稿日期：2018-03-09 编辑：陶希睿）