沙田柚乙烯应答因子的鉴定和生物信息学分析

李璐璐，陈玉梅，罗 琼，李惠敏，秦新民

(广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541004)

乙烯是一种植物体内产生的气体激素[1]，它参与花的发育、促进果实的成熟、组织的衰老和各种胁迫反应等生理活动，可在自身发育以及各种环境因子所诱导下产生。茄科植物中,乙烯对花发育的调控受到乙烯合成关键酶基因影响[2]。而乙烯应答因子(ethylene response factor, ERF)是植物中存在的一类转录因子，对植物生长发育过程中面临到的一些胁迫应答起着重要的作用[3-4]。雷明等[5]证明了ERF转录因子参与乙烯调控路径，促进蜻蜓凤梨花柄的发育。王萱[6]发现柑橘乙烯诱导酯酶基因可被乙烯和伤害处理诱导而大量表达，在柑橘抗逆反应中起重要作用。其机理为植物细胞的乙烯受体蛋白与植物体产生的乙烯结合诱导促EIN3/EIL1基因的表达，从而促发乙烯的下游反应，EIN3基因编码蛋白则通过结合到ERF基因的启动子区，调控后者的表达，使得植物体产生应答响应。其中，EIN3基因的高表达及其蛋白的积累在植物雌配子发育中有重要作用[7]。

沙田柚属芸香科柑桔属，在我国广东、广西的栽培面积较大。沙田柚具有配子体自交不亲和性，在自然授粉情况下坐果率极低，生产中必须进行人工授粉，较费时费力，不利于生产。植物自交不亲和性是指植物不能正常地完成受精作用过程，主要表现在雄株产生的花药不能与雌株的柱头特意进行识别从而萌发，或者花药可以正常萌发但是花粉管却不能正常地生长，或者是花粉管可以正常生长，但是两个配子不能完成精卵融合过程[8]。目前，沙田柚配子体自交不亲和性的研究在细胞学和蛋白质化学等方面取得了一定进展[9-14]，但尚未见乙烯应答因子基因与沙田柚自交不亲和性相关的研究报道。本研究在对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序的基础上，获得了沙田柚乙烯应答因子基因(Unigene16183_All)，并对该基因在未授粉、自花与异花授粉1～3 d花柱中的表达，以及其编码蛋白质的理化特征进行分析，旨在为深入研究乙烯应答因子基因的功能和沙田柚自交不亲和的分子机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为沙田柚未授粉、自花与异花授粉花柱，处理与采集方法按文献[15]的报道进行。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取、建库和测序 按改良Trizol 法对总RNA进行提取[16]，转录组的建库和测序参照文献[15]。

1.2.2 序列分析和系统树构建 乙烯应答因子基因序列和编码蛋白质的理化性质分析分别采用DNAMAN、NetPhos 3.1 Server、SOPMA等软件进行。

2 结果与分析

2.1 基因的生物信息学分析

基因(Unigene16183_All)序列全长为1013 bp (GenBank登录号：MG905213)。通过生物信息学软件DNAman以及NCBI网站上的NCBI ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)对序列进行分析，该序列的开放阅读框共有498 bp，编码166个氨基酸(图1)。

图1 Unigene16183_All序列和推测氨基酸序列

2.2 编码蛋白质的理化性质分析

运用在线软件(http://web.expasy.org/protparam/)对该蛋白质进行理化性质的预测分析。结果显示：该基因编码的蛋白质分子分子式为C800H1269N235O255S6，分子质量为18.45 kDa，等电点PI为7.90。构成该蛋白质的氨基酸中，苏氨酸(Ser)所占比例最大，为14.5%，半胱氨酸(Cys)所占比例最少，仅为0.6%。蛋白质不稳定系数(Instability index)为72.06(>40)，属于不稳定蛋白。其中，该蛋白质携带的负电荷氨基酸(Asp+Glu)与正电荷氨基酸(Arg+Lys)总数分别为19和20。利用DNAman软件对该蛋白质进行疏水性分析，结果见图2。从图中可以看出该基因编码的肽链中疏水性最大值约为2.14，位于第121位氨基酸，最小值约为-3.05，位于第14、15位氨基酸。该蛋白质疏水性平均值为-0.561，鉴定该蛋白质为亲水性蛋白。

图2 Unigene16183_All蛋白疏水性分析

2.3 功能结构域分析

将该基因编码的氨基酸序列用NCBI上的Conserved Domain Search进行鉴定，结果显示发现该蛋白质含有一个与AP2 superfamily蛋白相同的保守结构域，如图3所示。

图3 Unigene16183_All蛋白保守结构域

2.4 跨膜预测

运用TMHMM-2.0对该蛋白的跨膜区域进行预测。结果表明该蛋白质位于膜外，不属于跨膜蛋白，结果预测如图4所示。

图4 Unigene16183_All跨膜区预测

2.5 蛋白质磷酸化位点预测

蛋白质磷酸化位点采用在线预软件NetPhos3.1Server进行预测。结果显示，Unigene16183_All基因编码的蛋白质，共有24个可能的磷酸化位点，其中丝氨酸(Ser)磷酸化位点共有18个，分别位于蛋白质的第5、16、40、45、46、55、77、128、130、139、149、151、152、153、154、157、163和165位；苏氨酸(Thr)磷酸化位点共5个，分别位于蛋白质的第44、91、155、158和160位；酪氨酸(Tyr)磷酸化位点仅1个，为蛋白质的第22位。可知此蛋白质的磷酸化以丝氨酸磷酸化为主，其次为苏氨酸和酪氨酸。

2.6 蛋白质二级以及三级结构的预测

运用在线软件SOPMA 对该基因编码的蛋白质进行二级结构域的预测，结果表明，在该蛋白质的二级结构中，α-螺旋所占比例为30.72%，延伸链18.07%，无规则卷曲47.59%，β转角占3.61%(图5)。

h:α-螺旋；c:无规则卷曲；e:延伸；t: β折叠图5 乙烯应答因子蛋白的二级结构预测

运用在线软件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)对乙烯应答因子氨基酸序列三级结构进行预测。结果表明：该基因编码的蛋白质三级结构含有1个α-螺旋和2个β-折叠，螺旋和折叠之间由无规则卷曲连接(图6)。

2.7 同源性分析

沙田柚乙烯应答因子基因编码的氨基酸序列与其他13种植物乙烯应答基因编码蛋白的同源性分析结果表明，沙田柚乙烯应答因子基因编码的氨基酸序列与甜橙(Citrussinensis,XP-006467696.1)和克莱门柚(Citrusclementina,XM-006449381.1)的同源性分别为100%和98%。此外，DNAman构建的系统发育树也表明沙田柚乙烯应答基因编码的蛋白质与克莱门柚和甜橙有很近的亲缘关系，属于同一个进化分支(图7)。

图6 乙烯应答因子蛋白的三级结构

Unigene16183_All(沙田柚，KU517851)，Citrussinensis(甜橙，XP_006467696.1)，Citrusclementina(克莱门柚，XM_006449381.1)，Heveabrasiliensis(橡胶树，XP_021692420.1)，Ricinuscommunis(蓖麻,XP_002522517.1)，Vemiciafordii(光桐，APQ474444.1)，Vemiciamontana(皱桐，APQ47365.1),Medicagotruncatula(蒺藜苜蓿,XP_003593690.1),Phaseolusvulgaris(菜豆,XP_007148088.1)，Lycopersiconesculentum(番茄,AY192370.1)，Solanumtuberosum(马铃薯,JN125861.2),Malusdomestica(苹果,GU732428.1)

图7基于氨基酸序列的乙烯应答因子蛋白系统发育树

3 讨论

AP2/ERF是转录因子基因家族中比例最大的一类转录因子。根据AP2/ERF结构域的数目和是否出现其他DNA结合域，划分为AP2、ERF、RAV和soloist 4个家族[17-18]。其中AP2蛋白家族在调控植物花的发育过程中具有非常重要的功能，参与花分生组织的建立、花器官发育和果实成熟[19-22]。同时，AP2转录因子对种子和果实的发育也有重要的影响。其方式为通过对胚、胚乳和种皮发育的影响从而调控种子的大小[23-24]。Chung等[25]发现番茄SLAP2a基因在花和叶中不表达，而仅在其果实发育和成熟过程中表达，存在明显的组织器官特异性。RNAi技术抑制番茄的SLAP2a基因表达的结果发现植株体内的乙烯含量增加，而果实提前成熟。Bartley等[26]对番茄不同的成熟期AP2转录因子的表达进行分析，结果发现该基因在绿色果实、转色期，以及红色果实中均有表达，但转色期的表达量最高。

通过对蛋白质结构保守域预测和氨基酸序列同源性分析，沙田柚的乙烯应答因子基因编码的蛋白质含有一个AP2 superfamily蛋白相同的保守结构域，其氨基酸序列与芸香科的甜橙和克莱门柚的AP2蛋白相似性很高，相似度分别为100%和98%。表明了本研究所获得的Unigene16183_All为沙田柚乙烯应答因子基因。

转录组测序数据表明，沙田柚乙烯应答因子基因在自交和异交花柱中的转录水平存在差异。利用 RPKM(Reads Per Kb per Million reads)[27]对该基因在不同样品中的表达进行分析，在未授粉花柱中的表达量为0.71，自交1 d的花柱中的表达量迅速上升(13.99)，自交2 d的表达量持续升高(31.08)，在自交3 d的表达量达到了最高(48.42)。 而在异交1 d的花柱中，该基因的表达快速升高(16.80)，异交2 d时持续升高(36.82)，但异交3 d的表达量则快速下降(18.98)。 以RPKM 值取2的对数值[log2(RPKM)] 对未授粉/自交1 d、未授粉/异交1 d、自交1 d/异交1 d花柱、自交2 d/异交2 d花柱和自交3 d/异交3 d花柱中该基因的表达水平进行统计，其log2(RPKM ratio)分别为 -4.30、-4.56、0.264、0.245、-1.35。以上数据表明，沙田柚AP2/ERF转录因子与授粉有关，无论是自交授粉或异交授粉，其表达出现急剧增加。鉴于目前尚未见AP2/ERF与植物授粉和自交不亲和关系的研究报道，其在沙田柚自交不亲和性反应中的作用机理有待深入研究。