产胞外多糖乳酸菌的选育

仝雪 曹珂珂 赵祝福

摘 要：为了筛选高产胞外多糖的乳酸菌，从酸奶、奶酪中通过富集和分离得到7株乳酸菌，以菌落拉丝实验为初筛指标和苯酚-硫酸法测胞外多糖产量的复筛方法得到1株高产胞外多糖乳酸菌的优良菌株YL2。并且对YL2菌株进行培养特征、个体形态特征和生理生化鉴定试验，初步确定YL2为乳杆菌属（Lactobacillus），其胞外多糖的产量为430.0mg/L。

关键词：乳酸菌；胞外多糖；選育；鉴定

中图分类号 Q935 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）13-0013-03

Abstract：In order to screen high-producing extracellular polysaccharide lactic acid，bacteria，seven strains of lactic acid bacteria were obtained from yoghurt and cheese by enrichment and separation.The screening test was performed using the colony wire drawing test and the screening method for extracellular polysaccharide production by the phenol-sulfuric acid method.One high-yield extracellular polysaccharide lactic acid bacteria was obtained which the strain was YL2.The culturing characteristics，morphological characteristics，physiological and biochemical identification tests of YL2 strain were carried out，and YL2 was preliminarily identified as Lactobacillus.The extracellular polysaccharide yield was 430.0 mg/L.

Key words：Lactic acid bacteria；Exopolysaccharides；Breeding；Identification

微生物胞外多糖是在微生物生长和代谢的过程中产生并且分泌到细胞外，常常渗透于周围空间和培养基中的一类多糖化合物。在自然环境中，微生物胞外多糖的存在起着保护菌株的作用[1-2]。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长过程中分泌出的一种特殊水溶性多糖物质[3]，是一种天然的高分子聚合物。从奶及奶制品中选育出的乳酸菌，可增稠奶制品，赋予奶制品良好的稳定性、风味和口感，使奶制品看起来细腻润滑、口味独特等[4]，并且它还具有良好的生理功效。目前，酸乳发酵的菌株产多糖的量较低，远不能满足生产所需[5]，因此，选育高产胞外多糖乳酸菌并优化产胞外多糖的工艺条件等仍是当下的重点。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 实验材料与试剂 酸奶、奶酪、泡菜、MRS肉汤培养基、脱脂乳培养基等。

1.1.2 主要仪器设备 显微镜、微生物培养箱、高速离心机、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、低温冰箱、超纯水系统等。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的富集与分离 分别选取10mL的酸奶、奶酪和泡菜，接种于装有100mL的MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养48～72h。取富集后的培养液1mL加入9mL无菌水，依次进行10倍梯度稀释至10-6，分别吸取-5、-6这2个稀释度的菌悬液0.05mL涂布于加有1%CaCO3的MRS平板上，每个稀释度做3个平行，37℃恒温培养24h左右。观察并记录菌落特征，选择有明显溶钙圈的菌落进行下一步实验。

1.2.2 乳酸菌的纯化和初步鉴定 为了获得纯培养物，选择溶钙圈明显的菌落在MRS平板上反复的划线直至得到单菌落。对纯化后的单菌落进行革兰氏染色实验以及过氧化氢酶试验，在试验结果中显紫色，G+，过氧化氢酶实验为阴性的菌株可以初步判断为乳酸菌。4℃的冰箱中保藏。

1.2.3 产胞外多糖乳酸菌的初筛 由于培养的乳酸菌的菌落粘度、外力拉丝度和它本身生产出的多糖产量呈正线性关系[5-6]，因此用菌落外力作用下的粘度大小可以作为乳酸菌胞外多糖产量高低的根据，将分离纯化的乳酸菌在MRS培养基上划线分离，37℃培养48h后，用无菌牙签向上拉伸，通过测量，选择菌落粘度大、拉丝长度较大的进行复筛实验。

1.2.4 产胞外多糖乳酸菌的复筛 （1）胞外多糖的提取：参考张玉龙[7]的方法，20mL、37℃培养24h的菌悬液，6000r/min离心20min，在离心后的上清液中加入10mL的TCA溶液，4℃静置12h，后6000r/min离心20min，取上清液加入透析袋中，4℃透析24h，再加入3倍体积的95%vol乙醇，4℃静置过夜，再次6000r/min离心15min，除去上清液，即得沉淀后的胞外多糖，备用。（2）胞外多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法，参照张惟杰[8]的做法，以葡萄糖制作标准曲线测定菌株的胞外多糖产生量。

1.2.5 产胞外多糖菌株的鉴定[9] 个体形态和菌落形态的培养与观察；生理生化鉴定：对产胞外多糖乳酸菌进行H2O2的测定实验、牛奶反应、V-P试验、H2S的产生试验和菌株生长条件的实验等。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离纯化 从酸奶、奶酪和泡菜中富集分离得到多种菌株，将有明显溶钙圈而且乳酸菌的菌落特征特典型的菌落选出来，再对这些菌落反复划线进行纯化，观察这些菌落的形态特征。其中G+、过氧化氢酶阴性，而且没有芽孢的菌株初步判定为乳酸菌，挑选7株菌株保存。

2.2 产胞外多糖乳酸菌的初筛 对7株乳杆菌进行初筛拉丝实验，选出相对较优的3株分别为MN1、YL2和PC2，如图1所示。

2.3 产胞外多糖乳酸菌的复筛 葡萄糖标准曲线为y=2.0025x+0.0206，R2=0.9947。通过苯酚-硫酸法测得MN1、YL2和PC2乳酸菌的胞外多糖產量分别为272.42mg/L、430.00mg/L、357.83mg/L，其中编号为YL2的菌株在MRS肉汤培养基中的EPS产量最高，选定为目的菌株。

2.4 产胞外多糖乳酸菌的鉴定 （1）菌落观察菌株YL2在MRS培养基上的菌落为圆形，乳白色，边缘整齐，湿润、有光泽，不透明，较粘稠，易挑起。（2）细胞形态观察 在显微镜下观察该菌株，为长杆状或短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性，紫色。（3）生理生化实验结果。

由表1可知，运动性实验、过氧化氢酶试验、葡萄糖酸盐产气、明胶液化试验、硫化氢试验结果均为阴性，说明YL2乳酸菌不运动、不产气、明胶不液化和无H2S气体产生；淀粉水解、牛奶试验等为阳性；由表2可知，该菌株可以利用葡萄糖和乳糖等，不利用半乳糖、麦芽糖等；由表3可知，YL2乳酸菌在耐盐实验中，NaCl浓度为2%、5%的固体培养基上均有生长，浓度越大菌落数越少，7%浓度下不生长；YL2乳酸菌在耐酸碱实验中，在pH4.5和6.0条件下生长，在pH7.5时不生长；YL2乳酸菌在温度梯度实验中，在35℃培养下的菌长势最好，10℃时生长缓慢。

根据上述形态特征观察、生理生化实验、糖发酵实验和菌种生长条件实验并对照《乳酸细菌分离鉴定及实验方法》[10]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[11]初步鉴定出YL2菌株为乳杆菌属（Lactobacillus）。

3 结论

通过富集、划线分离从酸奶中分离纯化出7株乳酸菌，采用初筛的菌落拉丝法测其粘度和复筛测其胞外多糖的产量，从7株乳酸菌中筛选出1株高产胞外多糖菌株YL2，其EPS产量为430.0mg/L。根据培养特征、形态特征和生理生化特征初步鉴定为乳杆菌属（Lactobacillus）。

参考文献

[1]霍思序，唐彦君，刘宁.乳酸菌胞外多糖生理功能的研究进展[J].食品科技，2013，2（9）：153-157.

[2]李超，王春凤，杨桂连.乳酸菌胞外多糖肠道黏附及免疫调节作用研究进展[J].食品科学，2014，35（11）：314-318.

[3]Ramchandran L，Shah N.Effect of exopolysaccharides on the proteolytic and angiotensin-I converting enzyme-inhibitory activities and textural and rheological properties of low-fat yogurt during refrigerated storage[J].Journal of Dairy Science，2009，92（3）：895-906.

[4]马静.乳酸菌产生的胞外多糖及其在乳品中的应用研究[D].保定：河北农业大学，2004.

[5]刘芳，黄丹，陈永贵，等.一株高产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定[J].中国乳品工业，2013，41（12）：17-18.

[6]田丰伟，丁虎生，丁娜，等.产胞外多糖的乳酸菌的简便筛选与鉴定[J].食品与发酵工业，2008，34（3）：15-19.

[7]张玉龙，胡平，王金龙，等.产胞外多糖乳酸菌的筛选及抗氧化特性研究[J].中国酿造，2015，34（10）：37-38.

[8]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1999：11-12.

[9]刘燕.高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养基优化的研究[D].郑州：河南农业大学，2009.

[10]凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999：85-86，117-124.

[11]BUCHNAN R，GIBBONS E.伯杰氏鉴定手册[M].北京：科学出版社，1984. （责编：张宏民）