杂交水稻种子纯度DNA指纹鉴定与田间鉴定结果的比较

张雯 丁显萍 张萍

摘 要：选取水稻品种（新优188）的6个批次，即14-2、14-6，15-1、15-5，16-7、16-8，分别进行DNA指纹鉴定及田间鉴定，将2种鉴定结果加以比较，结果表明，杂交水稻种子纯度DNA指纹鉴定结果均低于田间鉴定的结果。

关键词：水稻；种子；纯度；小区种植鉴定

中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）13-0011-02

品种纯度是指品种个体与个体之间在特征特性方面典型一致的程度，用本品種的种子数（或株、穗数）占供检验本作物种子数（株、穗数）的百分率表示[1]。品种纯度的高低对作物的产量和品质都有较大影响，在种子生产、加工、贮藏及经营贸易中具有重要意义。DNA指纹方法是通过化学方法使水稻DNA从样品中分离出来，弃除样品中的蛋白质、脂肪、多糖及其它次生代谢物，以及样品中加入的三氯甲烷、异戊醇、乙醇等试剂，获得纯化的DNA，作为PCR反应的模板；对模板进行扩增，得到的产物在电泳过程中的电荷效应作用下进行分离，通过显色显示水稻DNA谱带类型。SSR标记由于具有数量丰富、多态性高、遗传上呈共显性、实验操作简单、结果稳定可靠、引物序列易交流等优点，已成为杂交水稻种子纯度鉴定的一种理想分子标记[2]。由于不同水稻品种遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异。这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同品种。田间鉴定是指选择土壤均匀、肥力一致的田块，配套适宜的栽培管理措施，对收获的种子进行小区种植鉴定，观察品种的特征特性，统计并计算结果。本研究将DNA指纹鉴定与田间种植鉴定的结果加以比较，以找出2种鉴定结果的差异，使DNA指纹鉴定的结果更有参考性。

1 材料与方法

1.1 材料 试验材料由安徽荃银高科种业股份有限公司提供，分别为2014、2015和2016年入库的新优188种子，每年随机选取2个批次，一共6批。

1.2 试验设计与方法 把选出的6批新优188的种子编号为：14-2、14-6，15-1、15-5，16-7、16-8，用DNA指纹方法检验各批的纯度，记录检测结果。同时在田间进行小区种植鉴定，将田间的杂株类型记录下来，计算纯度结果，与室内检测的结果进行比较。

1.2.1 DNA指纹鉴定 （1）将选出的6批种子，先进行发芽[3]，7d后选取合适的幼苗进行引物筛选，选用其中2对引物RM297和RM190继续纯度检测试验；（2）把每一批种子随机取出400棵幼苗，研磨，加入提取液，水浴，再加入三氯甲烷、异戊醇、乙醇等药剂，提取DNA；（3）制作反应体系，根据NY/T1433-2014中的反应程序进行PCR，94℃下预变性2min，进行30次扩增反应循环（94℃下变性45S，55℃下退火45S，72℃下延伸1min），然后72℃下延伸8min，最后10℃恒温冷却；（4）将PCR产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳及染色检测，观察胶片并记录结果。

1.2.2 田间种植鉴定 （1）试验地选择：考察田地前作状况，同时选择肥力一致且良好的田块；（2）小区设计：在同一田块将6个样品相邻种植，以突出它们之间的细微差异，每个样品种植400株；（3）小区管理：在整个生长阶段检查小区的植株状况，观察品种的特征特性，注意除草剂使用，避免影响植株的特征特性；（4）鉴定和记录：在整个生长季节随时观察，重点在花期和成熟期，根据品种特性鉴定并记录下杂株类型和数量[1]。

2 结果与分析

2.1 DNA指纹鉴定结果 从表1可知各批种子DNA指纹鉴定的纯度结果，每批鉴定株数均为400株，根据公式：纯度（%）=（株数-R-A/B/S-其他杂株）/株数×100计算结果。14-2纯度为96.3，14-6纯度为97.5，15-1纯度为96.8，15-5纯度为96.5，16-7纯度为97.8，16-8纯度为97.0。

2.2 田间鉴定结果 由表2可知，田间鉴定各批株数为400株，通过对整个生育期的观察，记录各批种子的杂株类型，纯度结果分别为98.8、99.0、99.0、98.5、99.8、99.3。

2.3 DNA指纹鉴定与田间鉴定结果的比较 将室内检测的纯度结果与田间鉴定的结果加以比较，可以看出每批样品的田间鉴定纯度结果要高于室内的结果，且都是高出1.5%以上，详见表3。

3 讨论与结论

比较DNA指纹鉴定与田间鉴定的结果，发现室内的结果均低于田间。田间鉴定主要在水稻生长过程中观察其品种的特征特性，而DNA指纹鉴定是在室内提取样品的DNA，通过扩增和电泳，得出结果。两种方法原理不同，结果有差异，目前国家标准以田间鉴定结果为准。田间种植鉴定是当前乃至今后一定时期内种子质量监管的主要任务和各种子质量监督检验机构的重要工作[4]。但对于企业来说，种子入库大约在当年的8月中下旬到12月底前后，而正季的田间鉴定是在次年的4月中旬播种，待整个生育期结束后才能看到纯度结果。种子入库后到播种之前就要包装销售，为了对市场负责，给包装销售提供可靠的依据，就需要室内先进行测纯，了解种子的质量情况。许多研究表明，利用DNA指纹鉴定技术鉴定品种真实性和纯度的方法是可行的，检测结果是准确的[5]。杂交稻大田用种的纯度标准必须高于96.0%，室内测纯的结果暂没有标准可依，但根据近几年的室内检测结果和田间鉴定的结果比较，发现基本都是室内测纯结果偏低，若室内测纯的结果也以大田标准来规定，会有部分合格种子暂时不能包装，如果室内检测结果的趋势与田间一致，找出某个品种的室内检测结果与田间鉴定结果的差异点数，不仅可提前为种子出库质量做参考，还能更准确的掌握该品种的实际质量水平。将入库的种子及时包装销售到市场，为来年的销售工作做好质量保障。品种真实性和纯度是种子质量的重要指标，对作物产量及品质具有直接的影响。因品种真实性和纯度问题造成大幅减产的事件时有发生，严重影响了农业生产。因此，加快分子检测技术的研发和应用，是当前种子质量管理工作的一项重要而迫切的任务[5]。对企业而言，室内纯度检测的准确性更加重要，种子在进入市场之前，质量需要严格把关，纯度是种子质量指标中尤为重要的一项，纯度不合格会严重影响来年的收成和品质。DNA指纹鉴定利用SSR分子标记技术进行纯度鉴定这种鉴定方法适用于杂交水稻种子纯度的快速鉴定。关键是要研究掌握室内检测与田间鉴定结果的关系，更清楚地了解品种特性，为市场销售减少风险，严格把好质量关。

参考文献

[1]李成荃，黄义德，杨惠成，等.安徽稻作学[M].北京：中国农业出版社，2007：362-366.

[2]李召华，朱克永，陈祖武，等.SSR分子标记技术在杂交水稻种子纯度鉴定中的应用[J].杂交水稻，2006（04）：11-14.

[3]GB/T 3543.1-1995 农作物种子检验规程[S].

[4]曹洪，杨俊.水稻小区种植鉴定技术与要求[J].现代农业科技，2014（08）：69+72.

[5]周会.利用分子生物学技术鉴定农作物品种真实性和纯度[D].雅安：四川农业大学，2012.

（责编：张宏民）