甘露糖结合凝集素基因多态性与结核病易感性关系的研究

余亮 谭自明 张斌 赵晶 木哈达斯·吐尔逊依明 李奇凤 罗新辉 孙荷

摘 要：目的 了解甘露糖结合凝集素基因多态性与新疆喀什地区结核病易感性的关系。方法 选取2015年12月～2017年12月在新疆喀什地区收集肺结核患者193例血液样本，收集同时期健康体检人员142例血液样本，采用试剂盒法提取全血基因组DNA，采用英国LGC公司生产的基于竞争性等位基因特异性PCR（KASP）技术的SNPline基因分型平台对选定的MBL基因SNP位点rs7096206进行分型，获得该位点的基因型频率和等位基因频率。结果 MBL基因rs7096206位点的三个基因型CC、GC、GG在结核患者组和对照组中的分布，差异无统计学意义（P>0.05），但从等位基因在两组间的分布上看，突变型碱基G在结核患者组中的频率高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 MBL基因rs7096206多态性位点与新疆结核病易感性存在关联，携带G碱基比携带C碱基具有更高的结核病发病风险。

关键词：甘露糖结合凝集素（MBL）；结核病；基因多态性；新疆

中图分类号：R521 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.13.019

文章编号：1006-1959（2018）13-0065-03

Abstract：Objective To investigate the relationship between mannose-binding lectin gene polymorphism and susceptibility to tuberculosis in Kashgar，Xinjiang.Methods From December 2015 to December 2017，193 blood samples of pulmonary tuberculosis patients were collected in Kashgar，Xinjiang.142 blood samples were collected from concurrent health checkups.The whole blood genomic DNA was extracted by kit method，and the selected SNP locus rs7096206 was obtained by SNPline genotyping platform based on competitive allele-specific PCR（KASP）technology produced by LGC，UK.Genotypic frequency and allele frequency of this locus. Results There were no significant differences in the distribution of three genotypes CC，GC and GG of MBL gene rs7096206 in tuberculosis patients and control group（P>0.05），but the distribution of alleles between the two groups was observed.The frequency of mutant base G in the tuberculosis group was higher than that in the control group，and the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion The polymorphism of MBL gene rs7096206 is associated with susceptibility to tuberculosis in Xinjiang，and carrying G bases has a higher risk of tuberculosis than carrying C bases.

Key words：Mannose binding lectin（MBL）；Tuberculosis；Gene polymorphism；Xinjiang

结核病（tuberculosis）是由结核分枝杆菌感染引起的传染病，据报道，全球超過1/3的人口曾经感染过结核分枝杆菌，但感染过结核分枝杆菌的人群中只有不到10%的人会发展成为活动性结核患者，个体的遗传因素可能导致结核病易感性的差异，遗传因素，宿主的基因可能在结核病的发生发展及转归中起到至关重要的作用[1]。易感基因在结核病发生发展中的作用越来越受到学者们的关注，甘露糖结合凝集素（MBL）是一种能特异识别糖类并与之共价结合的糖蛋白，广泛分布于人的肝脏和血液中，通过补体系统参与机体的微生物防御反应及免疫调节反应[2]，人MBL基因位于10号染色体10q11.2区，含有5个外显子，MBL基因突变可能影响MBL的二级结构，产生无活性的寡聚体，导致血清中的MBL浓度降低，MBL基因多态性可能对结核病的易感性产生影响。

1资料与方法

1.1研究对象 选取2015年12月～2017年12月在新疆喀什地区收集肺结核患者193例为病例组，所有病例确诊均严格按照中华医学会结核病学分会制定的《临床诊疗指南：结核病分册》的诊断标准[3]，胸部X线检查发现肺部组织存在典型的活动性结核病变，肺部病变标本、病理学诊断为结核病变；在患者知情同意的情况下，填写调查表，调查内容包括患者的性别、年龄、民族、身高、体重、职业、婚姻状况、学历、饮酒、吸烟、饮茶、卡介苗接种史的情况等。收集同时期健康体检人员142例为对照组，性别和年龄与结核患者组相匹配。对照组纳入标准为：①X线检查未发现活动性肺结核病灶、病理性钙化灶和病理性肺阴影；②无结核病史；③无糖尿病、严重心、肝、肾等器质性病变；④与病例组的患者无血缘关系。

1.2方法

1.2.1采用血液样本 EDTA抗凝管采集研究对象晨起空腹静脉血3 ml，摇晃后置于冰箱冷藏备用。

1.2.2提取血液DNA 使用天根生化科技有限公司生产的基因组DNA提取试剂盒（血液/细胞/组织）提取全血基因组DNA，按照试剂盒说明书的实验步骤进行操作：取一支EP管，管中加入300 μl抗凝血，再加入900 μl细胞裂解液A，温和混勾，12000 rpm离心1 min，小心弃去上清，留下细胞核沉淀；向沉淀中加入600 μl缓冲液B，温和震蕩混勾，加入10 μl蛋白酶K，颠倒10次混匀（约15 s），65 ℃水浴15～30 min至沉淀完全裂解；将混匀的液体转入离心柱中，静置2 min，12000 rpm，离心1 min，弃废液；再次12000 rpm离心2 min，将离心柱置于新离心管中，并打开离心柱盖，于室温放置5～10 min至无明显乙醇味；在硅质膜中央加入100 μl Solution E，置于室温5 min后，12000 rpm离心2 min；离心得到的溶液再次加入离心柱中，室温放置2 min，12000 rpm离心2 min，所得到的溶液问纯化后的DNA，置于-20 ℃保存备用。

1.2.3 DNA浓度和纯度的测定 采用美国Gene公司生产的微量核酸测定仪Nonodrop Lite检测DNA浓度和纯度，浓度低于10 ng/μl或A260/A280比值过大或过小的样本将被弃用。

1.2.4基因分型 采用英国LGC公司生产的基于竞争性等位基因特异性PCR（KASP）技术的SNPline基因分型平台对选定的MBL基因SNP位点rs7096206进行分型，获得该位点的基因型频率和等位基因频率。引物序列为F：5'-ACGTTGGATGACGGTCCCATTTGTTCTCAC-3'，R：5'-ACGTTGGATGTTCATCTGTGCCTAGACACC-3'。

1.3统计学分析 运用EXECL 2003录入数据，SPSS 13.0进行数据处理和分析，组间各位点基因型频率和等位基因频率差异比较采用？字2 检验；以P<0.05为差异有统计学意义，采用非条件Logistic回归模型进行多因素分析，计算比值比（OR）及95%置信区间（CI）。

2结果

2.1一般资料 共收集结核患者193例，其中男性99例，女性94例，年龄19～87岁，平均年龄（59.83±14.86）岁；共收集同时期健康体检人员（对照组）142例，其中男性78例，女性64例，年龄19～79岁，平均年龄（52.63±18.81）岁；两组间在性别和年龄上差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.2 MBL基因rs7096206位点基因型在结核患者组和对照组中的分布 结核患者组中MBL基因rs7096206位点的野生型CC、杂合型GC、突变型GG三种基因型占比分别为61.66%（119/193）、36.79%（71/193）、1.55%（3/193），在142例对照组中三种基因型占比分别为72.53%（103/142）、26.76%（38/142）、0.70%（1/142），可见突变型碱基G在结核患者组的比例要高于对照组，但经过？字2检验，MBL基因rs7096206位点的三种基因型在结核患者组与对照组之间的分布差异并没有统计学意义（？字2 =4.484，P=0.106>0.05）。

2.3 MBL基因rs7096206位点等位基因C和G在结核患者组和对照组中的分布 结核患者组等位基因C和G的频率分别为80.05%（309/386）、19.95%（77/386），对照组等位基因C和G的频率分别为85.91（244/284）、14.08%（40/284），经过？字2 检验，等位基因在两组间的分布差异有统计学意义（？字2 =3.903，P=0.048<0.05），突变型碱基G在结核患者组中的分布显著高于对照组，可见，携带G碱基比携带C碱基具有更高的结核病发病风险。

2.4 环境与遗传对结核病发病的多因素分析 为排除其他危险因素的影响，采用多因素非条件Logistic回归模型，以结核患者组和对照组为因变量，以MBL基因rs7096206位点基因型为分类自变量，在调整了性别、年龄、吸烟、饮酒等因素后，分析MBL基因rs7096206位点与结核病易感性的关系，结果显示纯合突变GG基因型和杂合突变CG基因型在结核病患者组中的分布显著高于对照组，携带纯合突变GG基因型的个体患结核病的风险是携带野生CC基因型的2.56倍（P<0.05，OR=2.56，95%CI：1.67-3.91），携带杂合突变CG基因型的个体患结核病的风险是携带野生CC基因型的1.27倍（P<0.05，OR=1.27，95%CI：0.82～1.95）。

3讨论

结核病的发生发展是由遗传因素和环境因素共同决定的，宿主易感基因在结核病发病机制中的作用越来越受到重视，众多与结核病易感性有关的基因浮现于学者们的视野中，MBL是钙离子依赖型凝集素成员之一，是机体免疫的一个重要组成部分，它能够特异性识别和结合多种病原体表面糖蛋白链末端的甘露糖残基，从而激活补体系统的免疫防御和免疫监视的作用[4]。

目前，关于MBL基因多态性与结核病易感性的关系，国内外已经有了多项研究，但尚未形成共识。美国一项研究认为MBL基因在美国的部分非洲裔人群和印度人群中等位基因的突变率明显高于对照组，MBL基因突变增加结核病的感染风险，但在白种人和西班牙裔人群中的研究数据却没有显示出MBL基因多态性与结核病有关[5]；国内刘洋等人采用限制性片段长度多态性技术对112例结核患者和120例健康对照者的MBL基因进行分型，发现结核病患者杂合子突变率高于对照组，因此认为MBL基因多态性可能与肺结核易感性有关，并与肺结核的复发相关[6]；Chen M等人通过对205例肺结核患者和216例对照者的病例对照研究发现，MBL基因rs7096206位点多态性与结核病易感性有关[7]。

本研究结果显示，MBL基因rs7096206位点的三种基因型在新疆喀什地区结核患者组和对照组间的分布差异没有统计学意义，但是等位基因在两组间的分布差异有统计学意义，突变型等位基因G在结核患者组中的分布高于对照组，MBL基因rs7096206位点碱基G可能是结核病的危险因素，本研究结论与新疆塔城地区的开展的一项研究结论相似，李宇等人在新疆塔城地区收集了231例肺结核患者和226例就健康對照，对MBL基因进行了多态性分析，发现肺结核组GG基因型显著高于健康对照组，认为MBL基因与新疆人群结核病相关，其可能是当地人群结核病的易感基因[8]。

研究基因多态性和疾病易感性关系时，由于受遗传或环境等其它混杂危险因素的影响，加之样本量又不足够大，容易导致研究结果无法真实反映基因与疾病之间的关系，为此本研究将性别、年龄、吸烟、饮酒、饮茶、卡介苗接种史等因素作为协变量纳入多因素Logistic回归模型中进行分析，结果显示携带GG或GC基因型的个体比携带CC基因型具有更高的结核病发病风险，这与一项博士毕业论文的研究结果较为相似，陈梦施等人在湖南省随机抽取了4个县级疾病预防控制中心登记的肺结核患者503例，将性别、年龄、婚姻、受教育程度、BMI等因素作为协变量进行多因素非条件Logistis回归分析，认为MBL基因rs7096206位点的GC基因型在肺结核患者租的分布高于健康对照组（P<0.05），GC基因型个体患结核病风险是CC基因型的1.427倍（OR=1.427）[9]。

关于MBL基因与结核病易感性的关联已经有了很多研究，但针对不同种族不同人群的研究并没有得到相对统一的结论，且MBL基因在结核病发生发展中的作用机制也尚不明确，有待于进一步研究和探索。

参考文献：

[1]Wu L，Deng H，Zheng Y，et al.An association study of NRAMP1，VDR，MBL and their interaction with the susceptibility to tuberculosis in a Chinese population[J].Internation J ournal Infectious Diseases，2015，38（C）：129-135.

[2]Hijikata M，Matsushita I，Hang NT，et al.Age dependent association of mannose binding lectin polymorphisms with the development of pulmonary tuberculosis in Viet Mam[J].Hum Immunol，2014，75（8）：840-846.

[3]中华医学会.临床诊疗指南：结核病分册[M].北京：人民卫生出版社，2005.

[4]Garred P，Genster N，Pilely K，et al.A journey through the lectin pathway of complement-MBL and beyond[J].Immunol Rev，2016，274（1）：74-97.

[5]杨春娥，冯喜英，久太.结核病易感基因的研究现状[J].中华肺部疾病杂志，2016，9（2）：207-209.

[6]刘洋，郭艳玲，孙琦，等.甘露醇结合凝集素基因多态性与肺结核易感性关系的研究[J].中国肺科杂志，2015，20（6）：971-974.

[7]Chen M，Deng J，Su C，et al.Impact of passive smoking，cooking with solid fuel exposure，and MBL MASP-2 gene polymorphism up-on susceptibility to tuberculosis[J].Int J Infect Dis，2014（29）：1-6.

[8]李宇，吴芳，章乐，等.MBL基因多态性与新疆汉族人群结核病易感性的研究[J].中国人兽共患病学报，2011，27（9）：769-773.

[9]陈梦施.湖南省汉族人群MBL与MASP2基因多态性与相关因素对结核易感性的综合影响研究[D].中南大学，2014：1-112.

收稿日期：2018-5-25；修回日期：2018-5-30

编辑/李桦