四逆汤对肾纤维化大鼠氧化应激反应的干预作用

王 艳，魏锦萍，裴妙荣

（1.山西中医药大学中药学院，山西晋中030619； 2.中国辐射防护研究院，山西太原030006）

肾纤维化是慢性肾脏疾病发展至终末期肾病的共同途径，无论基础疾病如何，慢性肾脏疾病一旦持续进展终将导致肾纤维化，肾纤维化持续进展的结果是肾功能进行性不可逆转的损害。近年来多成分、多靶点的复方中药治疗肾纤维化，作为延缓慢性肾脏疾病进程的治疗方法日益受到人们的重视。研究表明温补肾阳法对肾损伤有一定的治疗作用［1］。本课题组在已结题的国家自然基金资助项目（30973712）研究中，发现组分配伍形式的四逆汤对甲减所致的肾损伤［2］具有良好的作用效果，为明确四逆汤是否对非甲减肾损伤具有治疗作用，本研究采用肾纤维化为模型，以治疗甲减药效最佳剂量组来研究四逆汤对氧化应激反应的干预作用及对肾纤维化的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠，56只，雌雄各半，体重200 g～220 g，SPF级。购自中国食品药品检定研究院，批号：SCXK（京）2014-0013。

1.1.2 实验药品 附子、干姜、甘草，购自北京同仁堂药店，鉴定分别为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliDebx.的子根、姜科植物姜ZingiberOfficinale Rose.的根茎及豆科甘草属植物甘Glycyrrhiza uralensisFisch.的根及根茎）。

1.1.3 实验试剂 氯化钠，批号：20080604，天津市瑞金特化学品有限公司生产：甲醛溶液，批号：20110325，天津市东丽区大毕庄镇欢坨工业园生产；乙醚，批号：20110327，天津市进丰化工有限公司生产；尿素氮（BUN）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、还原型谷胱甘肽（GSH）、肌酐（GR）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所生产。肾衰宁，沈阳东新药业有限公司生产。

1.1.4 实验仪器 TV-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司生产；UV-6100S型紫外可见光分光光度计，上海元析仪器有限公司生产；HH-6数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司生产；TG16-W离心机，湖南湘立科学仪器有限公司生产；DNM-9602酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司生产；DHC-9075A电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司生产；FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器，江苏金坛市环宇科学仪器厂生产。

1.2 实验方法

1.2.1 药物制备 四逆汤有效组分配伍溶液的制备：按照预实验结果采用附子∶干姜∶甘草=1∶1∶1 配伍组，即附子提取物 1.2 g、干姜提取物 0.75 g、甘草提取物3.9 g溶于100 mL水中得。附子草提取物、干姜草提取物、甘草提取物制备方法见参考文献［3］。

1.2.2 分组及造模给药 取56只大鼠，根据文献方法［4］结扎单侧输尿管建立大鼠肾纤维化模型。以 10%水合氯醛（0.1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，固定大鼠剃毛、消毒。在左侧肋缘下做长约1～1.5 cm的纵行切口，逐层剥离皮下筋膜，切开肌肉，暴露肾盂，找到输尿管，取中段结扎，关闭腹腔，逐层缝合，撒上青霉素粉末，并肌肉注射青霉素溶液（0.1 mL/100 g）。假手术组不结扎输尿管，其余操作同手术组。造模2 w后，假手术组、模型对照组灌蒸馏水1 mL/100 g，四逆汤组灌四逆汤有效组分配伍药物（0.585 g/kg），肾衰宁组给予肾衰宁药物水溶液（0.432 g/kg）。

1.2.3 样本采集 药物干预后，将大鼠禁食、不禁水12 h，收集尿液，测定尿蛋白含量。腹主动脉采血分离血清，测定血清BUN及Cr含量；取左侧肾脏，剪取1/3称重后置于离心管中用作匀浆用，用生理盐水制备成10%匀浆液，测定肾组织MDA、SOD及GSH含量；剩余2/3用10%中性福尔马林固定后HE染色，观察病理损伤程度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 四逆汤对肾纤维化大鼠尿蛋白、血清尿素氮及肌酐含量的影响

与假手术组比较，模型组尿蛋白及血清尿素氮、肌酐含量明显升高（P＜0.05）；与模型对照组比较，四逆汤组及肾衰宁组可显著降低模型组大鼠尿蛋白、血清尿素氮和肌酐水平（P＜0.05）。结果见表1。

表1 四逆汤对肾纤维化大鼠尿蛋白及血清BUN及CR的影响（±s）

表1 四逆汤对肾纤维化大鼠尿蛋白及血清BUN及CR的影响（±s）

注：与假手术组比较，1）P＜0.05；与模型对照组比较，2）P＜0.05

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2.2 四逆汤对肾纤维化大鼠肾脏组织MDA、SOD及GSH含量的影响

与假手术组比较，模型组MDA含量明显升高（P＜0.05），SOD 含量明显降低（P＜0.05），GSH 水平有所降低；与模型对照组比较，四逆汤组及肾衰宁组可显著降低模型组大鼠肾组织MDA水平、升高 SOD水平（P＜0.05），在一定程度上升高 GSH 水平。结果见表2。

表2 四逆汤对肾纤维化大鼠肾脏组织MDA、SOD及GSH含量的影响 （±s）

表2 四逆汤对肾纤维化大鼠肾脏组织MDA、SOD及GSH含量的影响 （±s）

注：与假手术组比较，1）P＜0.05；与模型对照组比较，2）P＜0.05

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2.3 四逆汤对肾纤维化大鼠肾脏组织病理的影响

假手术组镜下可见肾皮质正常，肾小管排列有序，无炎性细胞浸润；模型对照组可见明显的肾小球萎缩、数量减少，肾小管排列紊乱，集合管内出现蛋白管型，髓质严重萎缩。四逆汤组与模型对照组相比，萎缩程度减轻，肾小管排列比较整齐。结果见图1。

3 讨论

图1 四逆汤对肾纤维化大鼠肾脏组织病理的影响

多数医家认为肾纤维化病机为本虚标实，脾肾阳虚为本，湿浊潴留为标。四逆汤临床应用广泛，对多种疾病均有显著疗效，四逆汤以辛甘大热之附子为君，荡涤内外寒气，温补肾中阳气，干姜回守中阳为臣，扶护后天，再使以甘草，正合辛甘化阳之旨，因此用四逆汤治疗肾纤维化符合本病病机。本研究发现，四逆汤可改善单侧输尿管结扎肾纤维化模型动物的病理损伤程度，降低模型动物24 h尿蛋白量及血清尿素氮和肌酐水平，说明四逆汤对肾纤维化动物有确切的治疗作用。

肾组织损伤后可导致组织缺氧和氧化应激损伤，而氧化应激又可进一步导致肾组织脂质过氧化与炎症反应，刺激促纤维化因子从而加快肾纤维化进程［4-5］。因此氧化应激反应在肾纤维化进程中具有重要的作用，减轻氧化应激发应可减轻炎症反应和肾纤维化病程。MDA是脂质过氧化代表产物之一，可反映氧化应激的严重程度，其高低间接反应机体细胞受自由基攻击的严重程度。SOD、GSH是重要的抗氧化剂，其氧化活性代表了体内抗氧化能力的高低。本研究表明，与假手术组相比，单侧输尿管结扎动物模型组，MDA含量显著升高，SOD及GSH含量显著降低，说明了肾纤维化氧化损伤的特点；四逆汤可降低肾纤维化模型动物肾脏MDA水平，升高SOD及GSH水平，提示四逆汤对肾纤维化的氧化应激损伤有干预作用，且其对肾纤维化的治疗作用可能与其对氧化应激损伤的干预作用有关。