FAT4、CUL4、YAP在胃癌组织中的表达及其临床意义

（深圳市宝安区人民医院，消化内科，广东 深圳 518101）

胃癌是一种常见的恶性肿瘤且发病率非常高。近些年，我国每年新发胃癌人数达40万左右，发病率占全世界41%左右[1]，同时具有年轻化的趋势。胃癌细胞的侵袭过程中有多种信号通路参与，如NF-κB、Wnt和Hippo信号通路[2-3]。随着Hippo-YAP信号通路与胃癌发生发展之间研究增加，发现Hippo-YAP通路能够调控细胞增殖和凋亡，在肿瘤细胞侵袭进程中发挥重要的作用[4-6]，可能成为靶向治疗的新靶点[7]。研究发现[8-10]，YAP蛋白在胃癌、大肠癌和肺癌等肿瘤中高表达，YAP蛋白是Hippo通路主要下游效应蛋白。CUL4是一类泛素连接酶，属于Cullin基因家族[11]，在食管癌、胃癌、结肠癌等多种肿瘤中表达升高，在肿瘤细胞形成过程中通过不同的分子调控机制发挥着重要作用[12]。但对于CUL4在调节胃癌细胞的侵袭过程中的作用报道较少。FAT4被称为Fat-J，在2004年被首次报道[13]。吴建林等[14]研究发现FAT4可能是胃癌发生、发展相关的抑癌基因，但FAT4胃癌细胞发生、发展中的具体机制研究较少。本研究针对性地研究FAT4及CUL4在调控Hippo通路对胃癌细胞侵袭过程中的作用和机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

经深圳市宝安区人民医院伦理委员会的批准，并经过患者的知情同意之后选取就诊于本院并住院行胃癌切除术的160例胃癌患者标本。其中，男性84例，女性76例；年龄（58±3）岁。所有入组患者临床病理资料完整，同时收集50例经2位经验丰富的病理科医师确定的正常胃黏膜组织标本作为对照。

1.1.1 纳入标准 在本院行胃癌手术的患者；术后病理诊断明确为胃腺癌。

1.1.2 排除标准 术后病理学诊断含有鳞癌、间质瘤等成分；术前接受过新辅助治疗；标本留取不符合标准；标本储存过程中有过冻融。

1.2 实验仪器及试剂

包埋机（美国Thermo公司），自动切片机（LEICA，型号RM2135），显微镜（日本Olympus CX21），载玻片（江苏世泰实验器材有限公司），恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司），全自动显微照相系统（日本Olympus公司），电泳装置（美国Bio-RAD公司），ECL化学发光检测系统（美国Santa Cruz公司）。

甘氨酸、矾酸钠、Tris碱、十二烷基磺酸钠、Tris-C1、叠氮钠（美国Sigma公司），蛋白定量试剂盒（Pierce公司），硝酸纤维素膜（S&S公司），抗鼠及抗兔二抗（上海华舜公司），FAT 4、β-actin、YAP、CUL4（美国 Santa Cruz公司），FAT4抗体（美国Novus Biologicals公司），DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），YAP抗体（美国Cell Signaling公司），CUL4抗体（美国Abcam公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组织化学法 ①切片：将石蜡包埋组织作4μm厚连续切片；②烤片：切片置于60℃温箱内过夜；③脱蜡：常规3级二甲苯脱蜡5 min，5级梯度酒精脱水1 min，蒸馏水冲洗3 min，冲洗3次；④阻断：3%过氧化氢H2O2甲醇溶液，室温孵育15 min，PBS冲洗3 min/次，冲洗3次；⑤抗原修复（高温高压加热法）：将修复液置于不锈钢高压锅中煮开，将水化好的组织片浸没在修复液中，煮沸1～2 min后，冷却；⑥封闭：切片加1滴正常非免疫动物血清，室温下孵育10 min；⑦加一抗和二抗：切片加1滴一抗置于湿盒中4℃电冰箱中过夜，PBS冲洗3 min，冲洗3次；加1滴生物素标记的二抗体，置于湿盒中4℃孵育30 min，PBS冲洗3 min，冲洗3次；加一滴链霉素抗生物素一过氧化物酶溶液，置于湿盒中4℃孵育30 min，PBS冲洗3 min，冲洗3次；⑧显色：切片1滴加新鲜配置的DAB溶液，显微镜下观察显色情况，适时终止反应；⑨复染、封片：切片苏木素复染4 min，清水冲洗，酒精脱水，二甲苯透明，干燥，中性树脂封片，显微镜下观察并进行判定。判定标准：按照染色强度，不着色为1分，浅黄色为2分，棕黄色为3分，棕褐色为4分；着色肿瘤细胞占计数细胞百分比例计分，无肿瘤细胞染色为0分，＞10%为1分，10%～35%为2分，35%～75%为3分，＞75%为4分；染色细胞百分比得分乘以着色程度得分为免疫组织化学最后评分，0到6分为阴性，8到16分为阳性。

1.3.2 Western blot ①上样和电泳：每组加相同量的蛋白，40 V恒流电泳，当嗅酚蓝带将要移出至胶底时终止电泳。②转膜：将电转移垫、滤纸、目的凝胶、PVDF膜、滤纸、电转移垫，放入转膜电泳槽中，加满新鲜的转膜缓冲液，低温条件转膜90 min左右（电流为200 mA）。③封闭：转膜结束后，将PVDF膜浸于脱脂奶粉封闭液中封闭1 h。④抗体孵育：PVDF膜用封闭后，加入1∶1 000一抗4℃孵育过夜，用PBS洗膜（10 min/次，3次），加入二抗，室温孵育1 h，再用PBS洗膜（10 min/次，5次）。⑤化学发光：按1∶1加入AB显影液（与二抗HRP结合），在ECL化学发光检测系统上显影。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，计数资料用例表示，比较采用χ2检验，指标相关性比较采用线性相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织中FAT4、CUL4和YAP的表达与性别、分化程度、病理类型及淋巴结转移的关系

胃癌细胞中FAT4、CUL4和YAP在性别、病理类型阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），在胃癌的分化程度及淋巴结转移之间差异有统计学意义（P＜0.05），且淋巴结无转移、分化程度较高的FAT4、CUL4和YAP阳性表达率高。见表1。

表1 胃癌组织中FAT4、CUL4和YAP的表达与性别、分化程度、病理类型及淋巴结转移的关系

2.2 正常胃组织及胃癌组织中FAT4、CUL4和YAP的表达

免疫组织化学结果发现，胃癌组织中CUL4和YAP表达量较正常胃组织增多，胃癌组织中FAT4表达量较正常胃组织减少，且FAT4、CUL4和YAP主要在细胞核、胞浆中表达，见图1。

2.3 胃癌组织及正常胃组织中FAT4、CUL4及YAP蛋白表达比较

Western blot检测，胃癌组织中CUL4及YAP蛋白表达量（1.18±0.19）和（0.89±0.21）高于正常胃组织（0.58±0.15）、（0.37±0.12），且差异有统计学意义（t=17.563和17.549，均P=0.001）；胃癌组织中FAT4蛋白表达量（0.42±0.11）低于正常胃组织（0.94±0.12），且差异有统计学意义（t=17.561，P=0.001）。见图2、3。

2.4 胃癌组织中FAT4、CUL4及YAP蛋白表达相关性研究

胃癌组织中FAT4与YAP的表达呈负相关（r=-0.931，P=0.012）；胃癌组织中CUL4与YAP的表达呈正相关（r=0.897，P=0.008）。见表2。

图1 胃癌组织及正常胃组织中FAT4、CUL4及YAP的表达 （×200）

图2 胃癌组织及正常胃组织中FAT4、CUL4及YAP蛋白表达

表2 胃癌组织中FAT4、CUL4及YAP蛋白表达相关性研究

图3 胃癌组织及正常胃组织中FAT4、CUL4及YAP蛋白表达比较

3 讨论

Hippo-YAP信号通路可通过一系列的信号转导及磷酸化激酶调节YAP的活性，从而影响肿瘤的发生及发展情况[15-16]。研究发现，胃癌细胞的增殖、侵袭与许多信号通路具有密切的关系，如Wnt/β-catenin、Hippo-YAP及AKT/mTOR等[17-20]。研究发现，在胃癌细胞中Hippo信号通路的效应分子YAP可以作为治疗靶点被VGLL4竞争性抑制[18]，同时造成胃癌细胞的生长停滞。因此，Hippo-YAP信号通路与胃癌的发生、发展具有密切的关系。

研究发现，FAT4蛋白在食管癌[21-22]、肝癌[23]中表达量降低。在胃癌组织中，FAT4低表达能够导致胃癌细胞增殖能力增强[24]。本研究发现，胃癌细胞中FAT4、CUL4和YAP在性别、病理类型阳性表达率差异无统计学意义，在胃癌的分化程度及淋巴结转移之间差异有统计学意义，且淋巴结无转移、分化程度较高的FAT4、CUL4和YAP阳性表达率高。研究发现[25]，YAP是Hippo信号通路的主要转录因子，且能够在胞浆与胞核之间穿梭。YAP的表达量在胃癌组织胃高于正常胃组织[26-27]。本研究发现胃癌组织中YAP蛋白的表达量高于正常胃组织，且胃癌组织中FAT4与YAP的表达呈负相关。同时MURPHY等[28]发现FAT4的缺失会造成YAP的核转位增加并导致胚胎恶性转化及肿瘤的发生。AZZOLIN等[29]研究发现，FAT4低表达能够增加细胞内的非磷酸化的YAP的表达量。研究表明[30]，FAT4低表达能够通过Hippo通路增加胞浆中YAP蛋白表达水平。因此，在胃癌中FAT4的低表达导致YAP蛋白表达量增加，这可能与Hippo信号通路的调节有关，说明FAT4可能通过调控Hippo-YAP信号通路抑制胃癌细胞侵袭过程。

胃癌组织中CUL4表达量高于正常胃组织[31]。QIAO等[32]研究发现CUL4能促进胃癌细胞恶性增殖和转移，本研究发现CUL4表达量在胃癌组织中高于正常胃组织，与以往研究结果相符[31]。CUL4高表达可以促进YAP进入细胞核，同时胃癌组织中CUL4与YAP表达呈正相关[33]。本研究发现胃癌组织中YAP与CUL4表达呈正相关，与以往研究结果一致。说明CUL4可能通过调控Hippo-YAP信号通路促进胃癌细胞侵袭过程。

综上所述，FAT4通过调控Hippo-YAP信号通路抑制胃癌细胞侵袭过程，CUL4通过调控Hippo-YAP信号通路促进胃癌细胞侵袭过程。