核酸检测应用于无偿献血者乙型肝炎病毒筛查的效果分析

周美洁 吴军军 吴敏珍 祝文坚 梁宇

（广西梧州市中心血站 广西 梧州 543002）

2010年6月开始，国家卫生计生委在全国进行核酸检测试点工作，以持续提高我国血站的血液筛查技术，确保临床输血的安全。2016年3月1日实施的《血站技术操作规程》（2015版）规定，核酸检测正式纳入到无偿献血者血液筛查的检测方法中。作为ELISA法血液检测的有益补充，NAT有效缩短了病毒检测窗口期，降低输血传播传播病原体的残余风险，特别是对于隐匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）的检出发挥了重要作用[1]。我站于2014年12月开始对部分献血者血液标本进行核酸检测，2015年10月全面对献血者血液进行核酸筛查，本文对梧州地区2015年1月至2017年8月38496份无偿献血者血液核酸检测HBV筛查结果进行分析，现报告如下。

1.材料与方法

1.1 标本来源

收集2015年1月至2017年8月梧州市中心血站无偿献血者血液标本38496人份，每次献血者同时留取两份血液标本，分别用于酶联免疫吸附试验（ELISA）和核酸检测（NTA）。根据《血站技术操作规程》要求，核酸标本需要在采集4h内3500×g离心15min，2～8℃冰箱保存，72小时内完成检测，如因特殊情况72小时内不能完成检测的，离心后24小时内在-20℃以下冻存。血液标本的标识、包装和运输过程符合国家相关要求。

1.2 仪器与试剂酶免检测仪器

TECAN SCHWEIZ公司全自动酶免工作站TECAN FREEDOM EVOLYZER-2200；瑞士HAMILITON公司Microlab FAME全自动酶联检测分析仪；核酸检测仪器：美国诺华公司Procleix TIGRIS SYSTEM核酸检测系统（转录介导的扩增技术-TMA），美国CHIRON公司试剂孵育仪RPI，ELGA纯处理水系统。ELISA检测试剂：北京万泰乙肝表面抗原诊断试剂盒，珠海丽珠乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒；NAT试剂：美国诺华公司的HBV、HCV、HIV-1NAT试剂盒（TMA法）。所有试验试剂经国家食品药品监督管理部门批准，每批试剂经过质量抽检，并进行确认合格后使用。

1.3 方法

对无偿献血者的标本同步进行酶免试验和核酸检测。ELISA试验：由酶免实验室检测人员严格遵照实验室操作规程，采用2种不同的试剂对样本进行HBSAg检测，结果判断标准：S/CO≥1为阳性，判断结果为不合格，对血液进行隔离报废；NAT检测：由核酸实验室工作人员采用全自动核酸检测系统及配套试剂盒（TMA-化学发光法）对血液同步进行HBV、HCV、HIV-1核酸联合检测，若血样核酸联合检测呈阳性反应，且ELISA检测HBSAg阳性，则认为核酸检测HBV-DNA呈反应性，不需继续进行后续的核酸鉴别试验。对核酸联合检测呈反应性而ELISA检测HBSAg阴性的标本进行HBV、HCV、HIV-1核酸鉴别检测，任一项呈反应性，判断为阳性。留取HBV-DNA阳性标本血清1ml，送梧州市某三级医院进行乙肝血清标志物五项检测。对HBsAg阴性而HBV-DNA阳性献血者进行随访，2个月后采集其血样进行HBsAg和HBV-DNA复检，留取血清送检乙型肝炎病毒血清标志物五项。在后续检测中HBV-DNA持续阳性，HBsAg发生阳性转化则定为HBV免疫“窗口期”；后续检测HBsAg仍为阴性，而HBV-DNA持续阳性和/或抗-HBc和/或抗-HBs阳性，则定为“隐匿性”HBV感染。

1.4 统计学处理

对本站38496份无偿献血者血液HBV筛查结果进行统计分析。计数资料采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 同步进行ELISA和NAT筛查的38496份无偿献血者血液中，采用血清学ELISA法检测HBsAg阳性，且HBV、HCV、HIV-1核酸联合检测阳性样本共132例，占全部样本的0.34%（132/38496），即血清学检测乙型肝炎病毒的阳性检出率为0.34%；对271例ELISA结果为阴性、NAT联合检测结果为阳性的样本进行鉴别实验，HBV-DNA阳性样本数101例，占全部样本的0.26%(101/38496)，即ELISA检测乙型肝炎病毒的漏检率2.6‰，病毒核酸检测乙型肝炎病毒的阳性检出率为0.61%(233/38496)。两种检测方法HBV阳性率比较见表1。

表1 两种检测方法HBV阳性率比较

2.2 82 例初次酶免实验HBsAg阴性而核酸检测HBV-DNA阳性标本送医院实验室进行乙型肝炎五项检测（化学发光法），其中抗-HBc阳性64例（占78.04%），抗-HBs阳性34例（占41.46%），抗-HBe阳性21例（25.61%占），HBeAg均为阴性，结果见表2。

表2 82例HBV-DNA阳性标本初次送检乙肝五项检测结果

2.3 对22例初次酶免实验HBsAg阴性而核酸检测HBV-DNA阳性的献血者进行随访，2个月后追踪检测的结果显示：16例追踪样本仍为HBV-DNA阳性，判定为隐匿性乙肝；6例追踪样本检测HBV-DNA阴性，怀疑初检HBV-DNA假阳性或病毒载量过低未检出；未发现后续检测中发生HBsAg阳性转化标本。

3.讨论

隐匿性乙肝感染是酶免检测主要的漏检原因之一[2]，大量证据表明，隐匿性HBV感染的血液可引起HBV经输血传播[3]。目前，NAT技术在我国已经全面覆盖应用到无偿献血者血液筛查中。通过本次研究发现：（1）我站完成38496份献血者样本中，血清学检测乙型肝炎病毒的阳性检出率为0.34%，病毒核酸检测乙型肝炎病毒的阳性检出率为0.61%；ELISA检测乙型肝炎病毒的漏检率2.6‰。核酸检测HBV阳性率与ELISA检测阳性率差异具有统计学意义（P＜0.01），证实了核酸检测可以很大程度上提高HBV的检出率，降低了ELISA方法检测漏洞的风险。（2）根据HBsAg阴性、核酸检测HBV-DNA阳性标本乙型肝炎五项检测结果显示，大多数抗-HBc为阳性，建议在献血者血液筛查中，血清学检测增加抗-HBc项目，这样可以在一定程度上降低乙肝病毒漏检的风险。（3）在追踪随访的样本中，6例HBV-DNA后续检测呈阴性反应，怀疑部分标本初次核酸检测为假阳性，也可能因为病毒复制和表达水平过低或宿主方面等的因素导致病毒未能检出；未发现后续检测中发生HBsAg阳性转化标本，即未发现HBV“窗口期”感染，可能酶免试剂的灵敏度、本次研究样本量大小等因素有关，需持续提高检测质量，继续对以后检出阳性样本进行追踪检测。

综上所述，病毒核酸检测应用于无偿献血者乙型肝炎病毒筛查，可以提高不合格标本的检出率，有效降HBV经输血传播的风险，进一步保障了临床输血的安全性。