获得性凝血功能异常患者血浆纠正试验与狼疮抗凝物质检测的相关性探讨

罗俭权，朱柏桂，邱 飞，陶珊花，冯天斌

(四会市人民医院，广东 四会 526200)

活化部分凝血活酶时间(APPT)是开展术科医院的凝血功能常规检测项目,凝血功能异常的患者，主要表现为获得性途径凝血异常，APPT延长，凝血活酶生成不良，而血小板功能计数、出血时间、PT、TT、vWF：Ag均正常，鉴别通过血浆纠正试验，以推断患者血浆中是否产生狼疮抗凝物质(LA),尽快诊断患者狼疮抗凝物质存在情况，将避免发生易栓症,降低严重体循环障碍和出血风险。本研究开展APPT血浆纠正结果推断狼疮抗凝物质浓度的相关性。现报告如下。

1 材料与方法

1.1一般资料：收集2015年1月～2017年10月在我院诊断的获得性凝血功能异常患者110例,轻型72例(66%)，中间型26例(23%)，重型12例(11%)。其中男73例，女37例，年龄19～78岁，平均34.5岁。诊断标准依据《出凝血异常与血凝学实验诊断指南》及推荐危险因素标准分型[1]。

1.2样本采集：静脉真空采血管采用广州阳普医疗科技股份有限公司生产的柠檬酸钠抗凝管，患者空腹抽血2 ml,2 500×g离心15 min分离血浆待测,无任何凝集、溶血、黄疸及脂血现象。同一患者按照狼疮抗凝物质结果分成三组:狼疮抗凝物质阴性组78例(71%)，阳性组32例(29%)，其中阳性低浓度抗凝物质21例，阳性高浓度抗凝物质11例。

1.3仪器及试剂：SYSMEX CS2100全自动血凝分析仪(希森美康医用有限公司生产)及其原装配套试剂和定标血浆质控品(e-check低、中、高值)。

1.4方法：①制备正常混合血浆(PNP)：混合至少20人份正常人血浆[2]。②采用APPT纠正试验，包括即刻法APPT及孵育法APPT纠正试验。将患者血浆与正常混合血浆量按1∶1比例混合，即刻及37℃孵育2 h后分别测定APPT。PNP 150 μl与高浓度抗凝物质血浆150 μl混合作为标准血浆，PNP 150 μl与患儿 血浆150 μl混合作为待测血浆； 将标准血浆与 待测血浆置于 37℃孵育 2 h后检测血浆延长时间关系，根据待测血浆血浆延长时间表现推断与抑制物浓度的关系，截取最接近标准血浆50%纠正单位，应用公式log对数计算抑制物浓度，然后 乘以相应的稀释倍数即为该份标本的抑制物浓度。③狼疮抗凝物质(LA)筛选：进行一期凝固法检测APPT。④狼疮抗凝物质(LA)确诊试验：用奎蛇毒试剂激活凝血因子FX，加入Ca和低浓度磷脂，检测血浆凝固的发生时间，称为Russell蛇毒时间(RVVT)。若RVVT明显延长，提示有凝血因子缺陷或存在LAC。加入正常血浆后RVVT缩短，则为凝血因子缺陷；若RVVT仍延长，提示有LAC存在。加入高浓度的磷脂中和LAC后，可使延长的RVVT缩短或恢复正常，确证血浆中存在LAC狼疮抗凝物质阳性。通过以APPT凝固点参数，进行dRVVT试验，检测血浆中的LA。设置计算的cutoff值(t/c)设为1.2以下，得出确诊试验检测值[3]。

1.5狼疮抗凝物质(LA)比值：应用以上两个完整的检测项目为标准，符合国际血栓与止血学会委员会发布的针对狼疮抗凝/磷脂依赖性抗体的LA检测标准。参考值：狼疮抗凝物比值(SLC-R)=0.8～1.2。LA比值(SLC-R)=LA筛选试验检测值(SLC-S)/确诊试验检测值(SLC-C)。LA比值>2.0为高浓度。LA比值=1.5-2.0为低浓度，LA比值比值<1.2为阴性[4]。

1.6统计学方法：应用SPSS的统计软件录入数据统计。应用各组APPT结果及狼疮抗凝物质比值进行正态检验分析,求出各自参数水平用中位数表示。应用等级相关系数Spearman非正态检验分别对三组APPT与狼疮抗凝物质检测结果进行相关性分析。应用非参数法构建绘制ROC曲线,计算正确诊断指数约登指数(Youden′s index′s index),即是灵敏度和特异度之和减去1的最大切点为临界点,对孵育法APPT进行两次切分,确定诊断值界点。计量资料采用四格表的χ2检验比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1APPT纠正试验结果与狼疮抗凝物质(LA)比值的相关性：将三组APPT试验结果与LA比值通过SPSS进行正态性w检验,均呈非正态分布。相关性结果显示三种方法的APPT检验结果均与LA比值呈明显的相关性。但孵育的APPT纠正试验结果，较原血浆、即刻法与LA比值相关性更显著。见表1。

表1110例分组 APPT 与LA浓度关系

类别中位数(s)r值P值原血浆APPT101.6(49.7～210.2)0.55<0.05即刻法APPT36.5(33.0～102.5)0.69<0.05孵育法APPT39.1(32.7～115.8)0.93<0.01

2.2绘制ROC曲线，评估孵育法APPT结果预测LA比值阳性的诊断界点。

2.2.1LA阳性和阴性临界点预测：以LA阳性(+)人群和LA阴性(-)人群作为ROC曲线分析的切点,对孵育的APPT纠正试验结果分析，ROC曲线下面积(AUC)=0.95(95% CI 0.961～0.987),Youden′s index值为0.819,所对应的孵育的APPT纠正试验秒数为39.6s(95% CI38.1～42.9),表示诊断狼疮抗凝物质阳性的最佳临界点。此时敏感度为88.0%,诊断特异度为94.9%，见图1，见表2。

图1 孵育法APPT诊断抑制物有无的ROC曲线

表2诊断界点为39.6 s时两组人群的分布情况

组别孵育法APPT(s) <39.6 ≥39.6 合计阴性组70878阳性组75259合计7760137

注：χ2=142.5,P<0.05

2.2.2LA阳性组中低比值与高比值临界点预测:对于LA阳性人群,以2.0作为分界点分为高浓度组(LA比值>2.0)和低浓度组(LA比值≤1.2～2.0)。利用ROC曲线对孵育法APPT预测LA低比值、高比值的临界点进行分析。AUC=0.971(95%CI0.962～0.994),Youden′s index值为0.879,所对应的孵育法APPT为53.6s(95%CI48.5～80.2),可以鉴别低比值与高比值LA的最佳诊断界点。此时敏感度为94.7%,诊断特异度为96.3%。见图2，见表3。

图2 孵育法APPT诊断LA低比值、高比值的ROC曲线

表3诊断界点为 53.6s 时低、高比值LA的分布预测

组别孵育法APPT(s) <53.6 ≥53.6 合计低浓度组35540高浓度组11819合计362359

注：χ2=86.2,P<0.01

3 讨论

APPT是获得性凝血系统较敏感和最为常用的筛选试验[5]，若异常抗凝物增多，一些患者存在狼疮抗凝物(LAC)，使APTT延长，需进一步开展纠正试验，如正常血浆和吸附血浆能纠正延长的结果而血清不能纠正，则为因子Ⅷ缺乏；如吸附血浆不能纠正，其余两者都能纠正，则为因子Ⅸ缺乏；如三者都不能纠正，则为病理性循环抗凝物质，可以预测患者形成狼疮抗凝物LAC阳性的可能性[6]。狼疮抗凝物是一种能延长凝血时间的获得性自身抗体，是一种会增加动静脉血栓形成风险性的蛋白质。以IgG型或IgM型或两者共存，是发生易栓性疾病的危险信号[7]。一旦狼疮抗凝物质大量形成,就可能造成获得性凝血功能异常患者的血栓形成,获得性凝血功能异常患者往往病情隐匿，更易导致严重血栓形成和溶栓出血事件[8]。临床逐步体会到抗凝物质问题的严峻性。抗凝物质的定性及定量监测,目前常用的抗凝物质检测方法包括筛查方法和确诊方法[9]。虽然可以明确抗凝物质比值情况,但上述方法对试验技术要求较高，受到检测试剂费用昂贵、操作步骤繁琐、难以标准化等因素的限制,我国现阶段可开展抗凝物质确诊试验的实验室较少，操纵复杂，报告周期长,短时间内很难实现普及[10]。

通过本文的相关性研究，从表1、图1、图2、表2结果表明应用孵育法APPT纠正试验结果高于39.6 s，能预测患者血浆中可能存在狼疮抗凝物(LAC),高于53.6 s，可以预测狼疮抗凝物(LAC)存在高浓度。当孵育法APPT纠正试验结果提示患者有LAC产生时，提示抗凝物质存在与否,及高、低浓度水平区分预测值。显示孵育法APPT纠正试验与抗凝物质比值之间的相关性明显高于原血浆及即刻的APPT,提示孵育的APPT可以更好地反应抗凝物质比值高低,结果越高,抗凝物质比值越高,这与理论值是相一致的[11-13]。所以，构建绘制ROC曲线，可以利用血浆纠正试验结果，建立预测获得性凝血功能异常患者狼疮抗凝物质的临界范围诊断值，即通过孵育的APPT预估抗凝物质比值区间。从ROC曲线分析，孵育法APPT结果预测抗凝物质阴性与阳性比值临界点AUC为0.959,低浓度与高浓度抗凝物质AUC为0.971,统计学上提示两者均得到了较高的预测价值。以孵育法APPT纠正试验结果39.6 s、53.6 s作为诊断临界值时,可以获得较高的诊断敏感度和诊断特异度,其Youden′s index值也最大值。因此，血浆纠正试验可以作为内源性凝血功能异常患者LA产生的早期预测指标。可作为抗凝物质监测的前期预试验常规开展，在现阶段无法开展抗凝物质定量监测医疗单位的补充，能解决早期判断?监测抗凝物质发生的重要筛查方法。