不同预处理方法下玉米芯水解效果的比较研究

李永莲, 阳元娥, 黎妍文, 刘文锋

(1.广东轻工职业技术学院 a.生态环境技术学院; b.食品与生物技术学院, 广东 广州 510300；2.五邑大学 化学与环境工程学院，广东 江门 529020)

玉米不仅是全世界总产量最高的粮食作物，还是动物重要的饲料来源。玉米发源于墨西哥，在全球范围内广泛分布，是深受人们喜爱的主要食物之一。玉米芯作为玉米经食用后留下的农业废弃物，长期得不到广泛利用，既造成环境污染，又带来极大的经济损失。玉米芯主要成分包括纤维素、半纤维素、木质素等，因此再利用价值高。目前国内外利用玉米芯生产燃料乙醇、生物柴油等生物能源，既可解决玉米芯的处置问题，又符合社会可持续发展要求。 但是纤维素和半纤维素因被木质素包裹，且纤维素的结晶结构对生物降解具有一定的抑制作用[1]，从而难以被降解。如果对纤维素和半纤维素直接进行糖化，水解得率相当低，难以实现直接生物转化。因此，在玉米芯发酵之前需进行预处理，即将固相中微生物可利用的有机质转移到液相中，破坏木质素的包裹作用，降低玉米芯纤维素的结晶程度，增加葡萄糖的含量，提高玉米芯的发酵效率。

为了增强玉米芯后续发酵效果，本文以玉米芯为原料，采用蒸馏水、稀酸、碱、酶等10种不同预处理方法分别对玉米芯进行预处理，测定预处理后水解液中葡萄糖的含量，采用傅立叶变换红外光谱(FTIR)观察预处理后玉米芯的纤维结晶结构变化，采用扫描电镜(SEM)观察预处理后玉米芯的纤维表面形态变化，以期找到一种经济且适于工业化生产的玉米芯的预处理方法。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

玉米芯，购自广西桂林，粉碎后过60目筛，置于75 ℃烘箱烘至恒重，然而置于样品袋干燥保存；纤维素酶和半纤维素酶，购自诺维信(中国)投资有限公司；微生物菌，由广东工业大学天然药物与绿色化学研究所筛选培养所得；菌种液体培养基(PDA 培养基)：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂16 g、水1 000 mL。

1.2 实验仪器

所选实验仪器为电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司生产)、KDC-16H 高速离心机(中佳公司生产)、立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备厂生产)、微量移液器(上海联圣实验仪器厂生产)、T-6 紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司生产)、Quanta 400F 热场发射环境扫描电镜(荷兰飞利浦 FEI公司生产)、TENSOR 37型傅立叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司生产)。

1.3 实验方法

(1) 玉米芯的蒸馏水预处理，称取玉米芯10.0 g，置于锥形瓶中，加入120 mL蒸馏水，设计 2 个重复实验，在湿热高压灭菌锅中于 120 ℃预处理1 h。

(2) 玉米芯的1.0%H2SO4预处理，称取玉米芯 10.0 g，置于锥形瓶中，加入120 mL 1.0%稀H2SO4，设计2 个重复实验，在湿热高压灭菌锅中于120 ℃预处理1 h。

(3) 玉米芯的1.0%NaOH预处理，称取玉米芯10.0 g，置于锥形瓶中，加入120 mL 1.0%NaOH，设计2个重复实验，在湿热高压灭菌锅中于25 ℃预处理0.5 h。

(4) 玉米芯的微生物预处理，称取玉米芯10.0 g，置于锥形瓶中，加入30 mL微生物，设计2个重复实验，置于35 ℃、100 rad/min恒温摇床中培养48 h。

(5) 玉米芯的纤维素酶预处理，称取玉米芯10.0 g，置于锥形瓶中，加入120 mL蒸馏水，利用NaOH稀溶液调节液体pH值至5.5，加入纤维素酶1 mL，设计2个重复实验，置于恒温摇床，在40 ℃、100 rad/min条件下培养 48 h[2]。

(6) 玉米芯的半纤维素酶预处理，称取玉米芯10.0 g，置于锥形瓶中，加入120 mL蒸馏水，利用NaOH稀溶液调节液体pH值至4.8，加入半纤维素酶0.1 mL，设计2个重复实验，置于恒温摇床，在40 ℃、100 rad/min条件下培养48 h[2]。

(7) 玉米芯的半纤维素酶协同纤维素酶预处理，称取玉米芯10.0 g，置于锥形瓶中，加入120 mL蒸馏水，利用NaOH稀溶液调节液体pH值至5.0，加入纤维素酶1 mL、半纤维素酶0.1 mL，设计2个重复实验，置于恒温摇床，在40℃、100 rad/min条件下培养48 h[2]。

(8) 玉米芯的1.0%H2SO4强化纤维素酶预处理，称取玉米芯10.0 g，置于锥形瓶中，加入1.0%稀H2SO4120 mL，设计2个重复实验，在湿热高压灭菌锅中于120 ℃预处理1 h，冷却后用NaOH溶液调节液体pH至5.5，然后加入纤维素酶1 mL，置于40 ℃、100 rad/min恒温摇床中培养48 h。

(9) 玉米芯的1.0%H2SO4强化半纤维素酶预处理，称取玉米芯10.0 g，置于锥形瓶中，加入1.0%稀H2SO4120 mL，设计2个重复实验，在湿热高压灭菌锅中于120 ℃预处理1 h，冷却后用NaOH溶液调节液体pH至4.8，然后加入半纤维素酶0.1 mL，置于40 ℃、100 rad/min 恒温摇床中培养48 h。

(10) 玉米芯的1.0%H2SO4强化半纤维素酶协同纤维素酶预处理，称取玉米芯10.0 g，置于锥形瓶中，加入1.0%稀H2SO4120 mL，设计2个重复实验，在湿热高压灭菌锅中于120 ℃预处理1 h，冷却后用NaOH溶液调节液体pH至5.0，然后加入纤维素酶1 mL、半纤维素酶0.5 mL，置于40 ℃、100 rad/min 恒温摇床中培养48 h。

1.4 分析方法

采用 DNS 法(3，5-二硝基水杨酸法)[3]进行葡萄糖含量的测定，采用环境扫描电镜观察玉米芯试样喷金后的纤维表面形态变化[4]，采用傅立叶变换红外光谱仪扫描预处理后的玉米芯样品，观察纤维素结晶结构变化情况[5]。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖含量的测定

用蒸馏水按适当倍数稀释离心后的玉米芯水解液，取适量溶液，按 DNS 法(3，5-二硝 基水杨酸法)测定葡萄糖含量，计算葡萄糖转化率，结果见表1。

表1 不同预处理方法下玉米芯水解液的葡萄糖转化率 %

由表1数据可以看出：

(1) 在蒸馏水加压处理下，玉米芯水解液中虽有葡萄糖检出，但是含量不高。

(2) 1.0%H2SO4处理，由于纤维素和半纤维素在酸性条件下稳定性较低，在一定的温度和压强下对其降解产生的葡萄糖较多，所以此种情况的玉米芯水解液中葡萄糖含量较高。

(3) 1.0%NaOH 处理，因为碱主要对木质素起作用，对纤维素和半纤维素的影响不大，所以经碱预处理后的玉米芯水解液中葡萄糖含量较低。

(4) 微生物处理，因为微生物既能分泌出纤维素酶，又能分泌出半纤维素酶，所以玉米芯水解液中葡萄糖含量较高。

(5) 直接酶法处理，半纤维素酶法处理效果不太好，较纤维素酶法处理效果差，而半纤维素酶协同纤维素酶法处理效果较好，水解效率较高，水解后溶液中的葡萄糖含量比单一的半纤维素酶法和纤维素酶法处理后高。

(6) 1.0% H2SO4强化酶法处理，经稀酸预处理后，纤维素和半纤维素部分被水解到溶液中，酶与纤维素和半纤维素接触更有效，酶解效率明显提高，可见稀酸强化酶法预处理效果较好。

综上所述，与碱法及直接酶法相比较，稀酸法预处理效果更好；直接酶法与稀硫酸强化酶法相比较，稀硫酸强化酶预处理效果更佳。另外，在半纤维素酶的协同作用下，纤维素酶的水解作用进一步提升。在10种预处理方法中，1.0% H2SO4强化半纤维素酶协同纤维素酶法预处理效果最佳，其次是1.0%H2SO4强化纤维素酶法，最后是1.0%H2SO4法。综合考虑经济成本，最优方法是1.0%H2SO4预处理法。

2.2 玉米芯的红外吸收光谱分析

图1为玉米芯的红外吸收光谱图。由图1可见，经1.0% H2SO4、1.0% NaOH、半纤维素酶预处理后玉米芯的红外吸收光谱图与经原料玉米芯、蒸馏水预处理玉米芯的红外吸收光谱图相比，其中相同点为：3 350 cm-1附近出现的吸收峰是形成氢键的羟基的伸缩振动吸收峰，这是纤维素中纤维的特征谱带；2 900 cm-1附近出现的吸收峰属于纤维素中亚甲基基团的伸缩振动吸收峰。在3 350 cm-1和2 900 cm-1处的吸收峰强度变弱，表明碳水化合物部分分解，致使羟基和亚甲基基团减少。不同点主要有：① 1 700 cm-1处为羰基伸缩振动吸收峰，对比预处理前后该吸收峰发现，经1.0% H2SO4和1.0%NaOH预处理后，该峰强度有所降低，但用酶处理后此处吸收峰基本消失，说明玉米芯的羧酸酯类化合物和酮类化合物在预处理时较大部分被水解。② 1 500 cm-1附近出现的吸收峰为苯环芳香核振动吸收峰，经1.0% H2SO4和酶预处理后，该峰强度有所下降，而用1.0%NaOH预处理后这个峰基本消失，说明预处理对木质素有一定的破坏，而1.0%NaOH对木质素的破坏最大。③ 纤维素组分最重要的两个特征峰为1 420 cm-1处吸收峰(纤维素中无定形区结构及纤维素Ⅱ构型)和1 430 cm-1处吸收峰(纤维素Ⅰ结晶区构型)。其中，经1.0%NaOH预处理后，1 430 cm-1处吸收峰强度有所增强，这说明经碱处理后样品结晶结构比例有所增长。而经1.0% H2SO4预处理后，1 430 cm-1处吸收峰强度有所下降，这说明经酸处理后样品结晶结构部分被破坏。④ 经1.0% H2SO4预处理后，1 255 cm-1、1 100 cm-1和898 cm-1处的吸收峰都下降为肩状，表明此种情况下玉米芯中的纤维素、半纤维素、糖类及其他碳水化合物部分被分解。这些结论与文献[5-6]中所报道的结果较一致。

综上所述，经不同方法预处理后玉米芯的结构均有变化，其中经1.0% H2SO4预处理后的变化较大，如碳水化合物分解，羧酸酯类化合物和酮类化合物水解，对木质素有一定的破坏，结晶结构破坏、纤维素、半纤维素、糖类及其他碳水化合物部分被分解等等。这些变化说明，用1% H2SO4预处理玉米芯有利于其后续发酵。

a.原料玉米芯；b.蒸馏水预处理玉米芯；c.1.0% H2SO4预处理玉米芯；d.1.0% NaOH预处理玉米芯；e. 半纤维素酶协同纤维素酶预处理玉米芯图1 玉米芯红外吸收光谱谱图

2.3 玉米芯纤维表面形态的扫描电镜分析

通过比较同一放大倍数(1 000×)不同预处理方法下的玉米芯纤维表面形态的扫描电镜谱图(图2)发现：原料玉米芯纤维的原始形貌清晰可见，纤维没有断裂，也未发现微孔(图2(a))；经蒸馏水预处理后玉米芯的表面形貌明显较原料玉米芯粗糙，出现极少部分微孔，未观察到纤维断裂(图2(b))；经1.0%H2SO4预处理后玉米芯纤维的结晶结构明显被破坏，纤维表面出现分丝甚至断裂现象，且出现了许多孔洞(图 2(c)和图3)。这个结果与文献[7]中所报道的现象较为一致。出现这种现象的原因是H2SO4脱除了大部分半纤维素，破坏了纤维素的结晶结构，说明1.0%H2SO4预处理法对玉米芯的后续发酵起到积极作用，是玉米芯水解的好方法。

(a) 原料玉米芯 (b) 蒸馏水预处理玉米芯 (c)1% H2SO4预处理玉米芯图2 玉米芯纤维表面形态的扫描电镜谱图

(a) 200× (b)500×

(c) 1000× (d) 3000×图3 不同放大倍数下1.0%H2SO4预处理玉米芯的扫描电镜谱图

3 结 论

(1) 在10 种预处理方法中，1.0% H2SO4强化半纤维素酶协同纤维素酶预处理效果最佳，其次是1.0% H2SO4强化纤维素酶法，最后是1.0% H2SO4法。综合考虑经济成本，最优方法为1.0% H2SO4预处理法。

(2) 通过红外吸收光谱分析经1.0% H2SO4预处理后玉米芯的变化可知：碳水化合物分解，羧酸酯类化合物和酮类化合物水解，对木质素有一定的破坏，结晶结构破坏，纤维素、半纤维素、糖类及其他碳水化合物部分被分解，这些变化说明用1.0% H2SO4预处理玉米芯非常有利于其后续发酵。

(3) 通过扫描电镜观察发现，经1.0% H2SO4预处理后玉米芯的形貌发生了明显形态学上的变化：大部分半纤维素被脱除，纤维素的结晶结构明显被破坏。