γ-PGA的基本特性、 生产方法及相关应用

张二伟,刘 宁,吴 涛,朱方剑,聂光军

(安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

γ-PGA是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过α-氨基与γ-羧基形成的γ-酰胺键聚合而成阴离子聚酰胺物[1]。它是由Sawamura于1913年在日本传统食品纳豆中发现。近年来,γ-PGA作为一种绿色、新型的高分子材料在医药、材料、环境等领域展现出其独特的优越性。作为一种应用潜力巨大的新材料,γ-PGA的价格居高不下。主要原因是其生产成本过高,尽管微生物生产γ-PGA的方法已成功建立,但其原料及工艺成本仍然较高。为解决这一问题,目前国内外相关研究主要集中于筛选高产野生菌株、菌种改造及其生产条件优化。

本文主要对γ-PGA的生产方式、分离纯化及在食品和医药等方面的应用进行综述,为推动γ-PGA的深入研究提供一定借鉴。

1 γ-PGA概述

1.1 结构特征与理化性质

γ-PGA通常由500～5000个左右的谷氨酸单体组成,相对分子质量在100～1000 kD之间,具有三种立体构型,分别为L-谷氨酸组成的均聚物(γ-聚L-谷氨酸,γ-L-PGA)、D-谷氨酸组成的均聚物(γ-聚D-谷氨酸,γ-D-PGA)和D-谷氨酸和L-谷氨酸混合组成的均聚物(γ-聚D/L-谷氨酸,γ-D/L-PGA)(图1)[2]。

图1 γ-聚谷氨酸结构图Fig.1 Structuralformula of γ-PGA

游离酸型γ-PGA的pKa为2.23,与谷氨酸的α-羧基的pKa值相差不多,γ-PGA金属盐(Na型)的比旋光度为-70,其热分解温度为235.9 ℃,熔点为223.5 ℃[3]。γ-PGA具有吸水性、可降解特性和良好的成膜性,这些特征是其应用拓展的基础。

1.2 吸水性与保水性

γ-PGA是由γ-酰胺键连接而成的直链分子,链之间存在大量的氢键,使得它具有良好的水溶性及吸水特性。王传海等[4]研究发现γ-PGA的最大自然吸水倍数可达到1108倍,比目前市售的聚丙烯酸盐类吸水树脂高1倍以上;对土壤水分的吸收倍数为30～80倍,是优良土壤保湿材料,在土壤中具有一定的保水力和较理想的释放效果,可应用于沙漠绿化工程中的抗旱保苗。

1.3 可降解性

研究发现γ-PGA可水解。吕莹等[5]研究发现:在强酸条件下,经105 ℃、真空下处理17 h后,γ-PGA可完全水解为谷氨酸,谷氨酸对环境无污染且可被利用。而γ-PGA的产生菌及一些其他自然菌株均能分泌相应的解聚酶,以γ-PGA为营养源进行生长[6],使得γ-PGA及其衍生的高分子材料可以在自然界中被迅速降解。所以,γ-PGA是一种理想的环保材料,具有很强的应用开发潜力。

1.4 成膜特性

γ-PGA是由谷氨酸单体聚合而成的高分子聚合物,分子链间可以通过缠结传递作用力,分子间粘滞力增强,具有良好的成膜特性。此外,γ-PGA分子链上有大量的羧基,为聚阴离子电解质,易与其他阳离子电解质形成聚合物,继而增强材料性质,被广泛应用。将γ-PGA与精氨酸(Arg)在低pH条件下自组装成纳米颗粒小分子,组装成的γ-PGA-g-Arg胶体纳米颗粒可用于包裹阿莫西林等抗生素,在胃酸下保护药物,在pH7条件下释放药物,做到药物的定点释放,有效地提高药效[7],能作为优良的药物载体材料。

2 γ-PGA的生产方法及改进

当前,制约γ-PGA应用的主要因素可能是生产分离成本过高。因此,突破γ-PGA的生产瓶颈对推动γ-PGA的应用开发研究具有显著的促进作用。目前,γ-PGA的生产方法主要有化学合成法、酶转化法以及微生物发酵法。

2.1 化学合成法

γ-PGA化学合成法最早采用的是肽合成法,即将前体谷氨酸逐个连接或采用片段组合形成多肽,整个过程一般包括基团的保护、活化、偶联和脱保护等。化学合成法对γ-PGA结构和功能关系的了解、γ-PGA合成酶反应机制的分析及γ-PGA实际应用修饰技术的发展等都具有一定指导意义。但该方法合成路线复杂、得到的γ-PGA分子量较小、副产物多、收率低且需要光电等有毒气体,故应用于工业生产的价值不大[8]。

2.2 酶转化法

酶转化法即采用生物酶一步酶促反应,避免了合成途径中复杂的反馈调节作用,一次可累积产物到相当高的浓度[9];同时,酶促反应体系中组分相对单一,显著降低了成品分离的成本。目前,利用酶转化法已经较为成功地应用于其他大分子的合成。如,利用酵母工程菌作为全细胞酶催化合成谷胱甘肽[10];构建高效表达S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyimethionine,SAM)合成酶的菌株催化合成SAM[11]等。理论上,γ-PGA合成过程中,谷氨酰转肽酶是其中的关键酶,它广泛存在于菌体内,能催化谷氨酞基转移到受体上,当供体和受体为同一物时则会发生自动转肽。如果以谷氨酸单体为原料实现生物聚合,利用酶的高效性和专一性,可以得到产物含量高、杂质浓度低的反应液,从而有利于产物的分离纯化[12]。但是,酶转化法生产的γ-PGA分子量小,而分子量的大小直接影响到γ-PGA的性质与功效,因此,基于不同目的,需要具有相应分子量的PGA,使得酶转化法受应面窄。这表明酶转化法应用具有很高的应用前景,但制约其发展的问题亟待解决。

2.3 微生物发酵法

自从Sawamura在日本传统食品纳豆中发现γ-PGA后,研究人员使用乙醇将γ-PGA从纳豆中分离提取出来。应用该方法从枯草芽孢杆菌和纳豆杆菌的发酵液中提取γ-PGA[13],这就是早期的微生物发酵法和醇沉法的结合。随着多种地衣芽孢杆菌(B.licheniforms)和枯草芽孢杆(B.subtilis)能在胞外积累γ-PGA的发现,这为微生物发酵生产γ-PGA提供了丰富的种质资源。但天然微生物的生产水平一般较低,为进一步提升微生物γ-PGA的生产水平,目前的研究主要集中在菌种和生产工艺过程等领域。

2.3.1 菌株的筛选与改进 目前,γ-PGA主要通过芽孢杆菌属的菌株,包括各种(纳豆)枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)进行生产。根据细胞生长是否需要L-谷氨酸,可以把γ-PGA生产菌分为两大类:L-谷氨酸依赖型和L-谷氨酸非赖型。相比之下,L-谷氨酸非赖型的菌株更适合工业化生产。但是,其生产性能仍然较为低下。为此,通过天然菌株的筛选与改进,提升其生产性能。

为生产更高品质的PGA,通过诱变育种选育高产菌株。朱丽娟[14]等通过硫酸二乙酯与亚甲基胍复合诱变γ-PGA生产菌株,得到了具有稳定遗传性状的高产菌株,产量达到10.72 g/L,产量提高了56.3%。王大芸[15]采用紫外、微波、氯化锂三种单一诱变及紫外-氯化锂,微波-氯化锂两种复合诱变方式进行诱变育种,多轮筛选获得一株底物(谷氨酸钠)耐受性为出发菌株的2倍;产量达24.00 g/L左右的菌株(比出发菌株高出约33%)。

随着基因工程技术的成熟,科研人员对PGA代谢调控机理进行了深入的研究(见表1)。

表1 PGA代谢调控优化研究Table 1 Study on the optimization and regulation of metabolism for PGA production

2.3.2 发酵方式的选择 微生物发酵方式与其发酵水平密切关联。PGA的微生物发酵法主要分为液态发酵和固态发酵两种方式。其中,液态发酵法方法简单,易于操作,且发酵过程可调控,使培养条件一直维持最优水平,在实验室中广泛应用。但随着液态发酵的持续进行,代谢产物的积累,发酵液的粘度越来越高,通风问题与搅拌问题成为液态深层发酵的主要阻碍。另外,发酵量的扩增使得解决上述问题的难度会几何倍数的增大,限制了液态发酵工业化大规模生产。相对而言,固态发酵具有一定的优势。该法生产γ-PGA基质来源广泛,创新的使用新的生产基质提高了产品的附加值(见表2)。

表2 固态发酵产PGA基质研究Table 2 Study on the matrix used for SSF of PGA

另外,固体发酵基质的洗脱液较液体发酵液成分简单,分离成本相对较低。因此,固态发酵替代深层液态发酵进行生产,不仅提高产品的生产效率,而且可以高附加值利用废弃资源,降低生产成本,经济效益显著增加。

2.3.3 发酵条件与过程控制 微生物发酵产PGA的另一优点是可通过调控发酵因素与过程提高产量。培养基的成分选择直接关系到微生物的生长和生产,Mitsunaga[29]首次揭示了碳源的选择作为效应物控制枯草芽孢杆菌生产γ-PGA的机理,通过对比甘油与葡萄糖作为唯一碳源生产γ-PGA的产量,以及生产过程中代谢组分的分析,发现Cod Y明显的抑制了γ-PGA的生产。这表明利用代谢手段释放γ-PGA的产量在理论上是可行的。Zeng[30]等发现发酵过程中加入201.2 mmol/L的K+可以有效的降低发酵液粘度,延长细胞活力,使γ-PGA的产量从18.36 g/L增加到25.62 g/L。而Meng等[31]通过添加Ca2+调节γ-PGA的生产,结果显示,PGA产量从6.8 g/L增加到9.7 g/L,谷氨酸脱氢酶(GDH)活性提高1.6倍,达到295 U/mg,Ca2+被证实为一种有效的PGA生产调控因子。

此外,发酵过程的优化可以将菌株的生产能力更好的表现出来,还可以通过因素的调控胁迫菌株生产,提高生产能力(见表3)。

表3 PGA生产工艺优化Table 3 Optimizing the process of PGA production

2.3.4 分离提取 PGA本质上是一个氨基酸均聚物,具有很多与蛋白质相同的生物学特性,因此很难将其与发酵同时产生的蛋白产物分离开。这为PGA的分离纯化带来了技术上难题。另外,不同的生产方式以及复杂的生产原料的添加都会增加后期分离纯化的难度,所以,选择一种简单、有效、通用的分离纯化方式变得尤为重要。

目前,有机溶剂沉淀法是较为普遍的γ-PGA的提取方法,主要通过加入低级醇或丙酮,达到从发酵液中沉降γ-PGA的目的,主要步骤如图2[37]所示。

图2 有机溶剂沉淀法示意图Fig.2 Organic solvent precipitation to extract γ-PGA

贺杨杨等[38]在有机溶剂沉淀法的基础上,结合化学盐析的方法,通过对发酵液的预处理,提高了γ-PGA的提取率与纯度,将提取率提升至95.21%,纯度高达96.89%,大大降低了乙醇用量,节约了生产成本。此外,新的分离方法的出现也为分离纯化提供了新的思路。王浩等[39]采用阴离子交换层析法,对γ-PGA进行分离纯化。通过阴离子树脂的静态吸附、动态实验,最终将γ-PGA的纯度由86.7%提高到96.2%。刘婷[37]创新的使用双水相体系从发酵液提取分离γ-PGA。通过对不同种类的PEG-盐双水相体系、有机溶剂-盐双水相体系和离子液体-盐双水相体系的探究,研究工艺条件和环境因素对提取率的影响,最终实现98.07%的高收率。

综上,微生物发酵法产γ-PGA具有培养条件温和、生产过程容易控制、生产周期较短、γ-PGA产量高且分子量适宜、提取率高、环境友好等优点,并已成为目前研究和生产γ-PGA的主要途径。但由于微生物的γ-PGA合成代谢途径尚未明确,具体调控机制尚不清楚等问题,这将成为γ-PGA生产提供新的研究热点。

3 γ-聚谷氨酸的应用

γ-PGA的特性研究发现其在医药、食品、材料、环保等方面具有广泛的应用前景,越来越引起人们的关注。

3.1 医药方面

γ-PGA在自然界或人体内能被微生物分解或通过正常的新陈代谢被机体吸收利用,不易产生积蓄和毒副作用,具有良好的生物可降解性和生物亲和性。γ-PGA分子链上具有大量活性较高的游离侧链羧基,易于修饰并能与药物有效结合形成稳定的复合物,一方面提升药物的溶解性,另一方面提高药物的稳定性、延长药物的降解时间等,从而提高药物疗效[40]。

顺铂[Cisplatin,cis-diaminodichloroplatinum(Ⅱ),CDDP]是近年应用最多的抗肿瘤药物之一,但是它的水溶性差,稳定性低,副作用也十分严重,严重影响了它的药用价值。将γ-PGA作为载体,巧妙地将γ-PGA与GDDP结合,形成的PGA-GDDP复合物,载药率可达到10%～20%[41],半衰期更长,毒性更低,并具有缓释的效果,在抗肿瘤活性和细胞毒性方面都明显优于顺铂。这表明γ-PGA是一种非常高效而且低毒的药物载体,能有效提升药物稳定性,在治疗肿瘤方面具有很大的应用潜力。

此外,γ-PGA有极好的助溶作用,可提升药物的溶解性。紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是有天然抗肿瘤药物,对各种癌症的治疗作用明显,但其自身水溶性极差,这很大程度上限制了紫杉醇药物在临床上的应用。γ-PGA与PTX结合形成复合物,大大增加了PTX的水溶性。而且在一定程度上延长了紫杉醇的化疗作用时间。经临床验证,该聚合物对乳房癌、卵巢癌等疾病治疗效果远高于紫杉醇单体[42]。

除了与药物结合增强药效外,γ-PGA的保湿性也能促进药物的疗效发挥。Shi[43]等将γ-PGA与丝胶蛋白(SS)混合制备成γ-PGA/SS水凝胶,可以刺激伤口肉芽与毛细血管的生长,保持伤口周围环境的湿润,有效防止伤口发炎,促进伤口愈合。Pereria[44]等将γ-PGA与硫酸软骨素、聚羟基乙酸内酯制备了新型生物复合材料γ-PGA-硫酸软骨素-聚羟基乙酸内酯,该复合材料既具有聚合氨基酸良好的细胞识别和黏附性,又具有聚羟基乙酸内酯优良的机械强度力学性能,同时还具有良好的亲水性和可降解性,是一种理想的软骨组织工程支架材料。可见,γ-PGA在医药领域具有广泛的应用价值及开发潜力。

3.2 食品方面

γ-PGA的降解产物为谷氨酸,对人体无毒副作用,添加到食物中可以通过促唾液分泌来刺激味觉、改善口感、增进食欲,并可以结合食物中的鞣质,去除涩味[45],因此可作为食品增稠剂、除涩剂等,在食品工业中有着广泛的应用。分子量低于200 kDa的γ-PGA具有极好的抗冻性,其抗冻活性明显高于目前公认的具有高抗冻活性的葡萄糖[46],对需要反复冻融或者对冷冻敏感的食品有很好的保护作用。此外,γ-PGA还具有保健功效。γ-PGA能够增加细胞内和细胞外Ca2+的溶解度,还能够促进Ca2+在肠内的吸收,促进骨骼健康[47],可用于制备促钙吸收的保健品。γ-PGA本身还是一种类膳食纤维,对增加肠胃蠕动,清除体内垃圾,维持人体消化和排泄系统功能具有良好的作用。

3.3 环保与农业方面

γ-PGA中含有大量的游离羧基提供了阳离子结合的基团,使其对金属离子有良好的吸附性。研究发现γ-PGA与Ni2+、Cd2+、Pb2+结合的能力均比羧基离子交换树脂要高,可制备成的絮凝剂,用于吸附重金属离子,有效减少污染[48]。γ-PGA还可用于浓缩放射性金属,从溶液中回收贵重金属,变废为宝[49]。γ-PGA可以作为农业化学品的缓释载体,在肥料、杀虫剂、除草剂、驱虫剂等使用时,加入适量的γ-PGA盐可以延长这些药物在作用对象表面的停留时间和活性成分的作用时间,使其不易因下雨而被冲刷掉,提高使用效果,减少化肥农药的使用量[50]。另一方面,γ-PGA吸水饱和后,呈凝胶状,可包裹在植物种子的表面上作为种子的理想包衣材料,提高种子的发芽率,使得原本在沙漠或缺水地区不能生长的植物也能顺利的发芽[51]。

3.4 化妆品方面

γ-PGA在化妆品药典上的国际命名为纳豆胶(Natto Gum),作为高效保湿成分,被添加到面膜、早晚霜等护肤品中,能够形成柔软平滑的缓释薄膜,有助于减少皮肤表面水分的散失速率,且没有一般保湿剂会有的粘腻感觉,能使皮肤干爽又水嫩,同时促进皮肤的弹性,促进皮下天然保湿成分(NMF)的蓄积,增进皮肤健康[52]。用于洗发护发产品中,能锁住毛发表面毛鳞片的水分、养护发质、滋养头皮、减少头屑产生、减少毛发枯燥等[53]。用于护肤的药膏中,能减轻皮肤因缺水引起的过敏、粗糙和皮肤损伤,提高皮肤免疫力、恢复细胞功能、提高新陈代谢。

3.5 其他方面

地震是是地壳快速释放能量过程中造成振动,期间会产生地震波的一种自然现象,Wang等[54]通过对台北、台中、高雄三个地区的地质研究发现,γ-PGA的分布及与地震发生有一定的关联,通过探究土质中的γ-PGA分布及其量变建立起一种新的评估地震概率的体系,对防范地震有着重要参考意义。

4 问题与展望

γ-PGA不仅在传统的食品,农业,环境等领域表现出其重要的应用价值,而且在医药临床、复合材料、大分子自组装等方面也展露其独特作用。但现阶段仍存在一些问题制约着γ-PGA的开发应用。在生产方面:随着γ-PGA应用开发与深入推广,γ-PGA的需求量越来越大,日益增长的需求量与落后的生产量之间的问题解决已迫在眉睫;在纯度方面:现阶段γ-PGA的分离纯化效率较低,导致产品的纯度不高,易含有其他蛋白等杂质,影响其应用;在分子大小方面:γ-PGA分子量大小与其用途密切相关,而现阶段的生产难以做到分子量定级生产,限制了γ-PGA的应用范围,增加了应用难度。

面对上述的主要问题,国内外学者正在以下方面开展相关研究:一方面寻求适合γ-PGA工业化生产的廉价原料,另一方面通过筛选、诱变高产菌株,特别是谷氨酸非依赖型合成菌,并对发酵条件进行优化,提高产量。随着对γ-PGA合成机制研究的深入和基因工程技术的成熟,传统方法对γ-PGA产量的提高越来越有限,而通过对基因和代谢流的改造,如提高关键酶的活性、增加正向调控蛋白的浓度、敲除γ-PGA的降解基因等,将会发挥越来越重要的作用；进一步探索新的分离纯化方法,探索开发新技术,设计生产新的分离设备。在利用基因工程菌提高γ-PGA产量与质量的同时,简化纯化工艺,大幅降低其分离成本；对γ-PGA分子量控制性机理的研究及其可控性生产工艺的设计,为实现γ-PGA的理性可控生产,满足应用的特异性要求提供了新的方向;并在此基础上,开发不同分子量γ-PGA的新功能,进一步拓宽其应用领域。