积雪草酸对大鼠离体肝细胞 线粒体损伤的防护作用

赵华龙,毛 涵,2,刘 佳,薛 菲,汤新慧,*

(1.盐城师范学院,江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室,江苏盐城 224051; 2.南京工业大学,生物与制药工程学院,江苏南京 210009; 3.江苏大学药学院,江苏镇江 212013)

积雪草(Centellaasiatica(L.)Urban)为伞形科积雪草属草本植物,在我国主要分布于华东、华南、中南及西南等地。积雪草除作为传统中药,用于外科疾病的治疗和美容保健领域外,也可以食用,在我国主要以干燥叶片入茶,在东南亚一些国家新鲜叶可作蔬菜或果汁[1-2]。现代药理学研究发现,积雪草除能抗菌消炎、抑制瘢痕增生及修复皮肤损伤外,还具有免疫调节与神经保护、抗溃疡、镇痛、抗抑郁、抗肿瘤等多种药理活性[2-3],而五环三萜类化合物积雪草酸(Asiatic acid,AA)为其最重要的有效成分,具有抗炎护肤、保肝护肺、抗抑郁、降血糖、抗肿瘤等多种生物活性[4-5]。

镉(cadmium,Cd)是一种重要的工业和环境污染物,极易在体内蓄积,对肝、肾、肺、睾丸、骨骼等多种器官均可造成损伤,其中,肝脏是镉最初积累和产生毒性的主要靶器官[6]。最新研究发现,镉的肝毒性机制主要与线粒体结构和功能的破坏有关[7-8]。

本研究在课题组前期初步发现积雪草酸能显著对抗肝细胞损伤、保护肝脏[9-10]的基础上,运用Cd2+诱发的大鼠肝细胞离体线粒体高通透性转运(MPT)模型,以线粒体肿胀度、膜电位耗散、线粒体内游离钙释放以及细胞色素c(Cyt c)和凋亡诱导因子(AIF)释放水平等为指标,探讨AA对镉诱发的肝细胞线粒体损伤的防护作用及其机制,旨在为AA的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Wistar大鼠 48只,雄性,体重180～220 g,南京医科大学实验动物中心,许可证号:SCXK(苏)2013-0005;积雪草酸、钌红(RR)、甘露醇、蔗糖、EDTA、琥珀酸、鱼藤酮、罗丹明(Rh123)、Fura-2/AM Sigma-Aldrich公司;Tris-HCl、Hepes Promega公司;兔抗人/大鼠/小鼠凋亡诱导因子抗体 R&D公司;鼠抗人/大鼠/小鼠细胞色素c抗体 Trevigen公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠及羊抗兔二抗 武汉博士德生物工程有限公司;DAB(either 3,3-diaminobenzidine)试剂盒 福州迈新生物技术开发公司;考马斯亮蓝试剂盒 南京建成生物工程研究所;氯化镉(CdCl2(2.5H2O) 上海国药集团化学试剂有限公司。

UV-2600型紫外可见光分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;Spectra Max M5型酶标仪 美国Molecular Devices公司;EL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Biofuge Primo R型冷冻离心机 Kendro 公司;Hitachi 850型荧光分光光度计 日立公司;Mini-Protein Tetra Cell型电泳仪、Gel DocTM XR+凝胶成像系统 Bio Rad公司;Scientz-10N型冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肝细胞线粒体的制备 实验用大鼠在湿度(60%±5%)、温度(20±2) ℃和12 h光照/12 h黑暗周期的标准条件下自由摄食和饮水,喂养1周后进行实验。实验前大鼠禁食12 h,禁水4 h,腹主动脉放血处死,取肝脏,在预冷的分离液(包括225 mmol/L甘露醇,75 mmol/L蔗糖,0.05 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris-HCl,pH7.4)中剪碎,洗净,冰浴匀浆,600×g离心5 min,取上清液,8800×g,4 ℃离心10 min,弃上清液,沉淀用4 ℃分离液洗3次,所得沉淀即为纯化的线粒体[10]。

1.2.2 线粒体蛋白浓度测定 用考马氏亮蓝法[10]测定线粒体蛋白浓度。取100 mg考马氏亮蓝G-250溶于50 mL 95%乙醇中,加入100 mL 85%磷酸并加水至1000 mL配成染色液。配制10～100 mg/L牛血清蛋白标准液,取0.1 mL标准液或待测蛋白浓度的样品溶液,加5 mL染色液,均匀混合,在595 nm处测定吸光值,制作蛋白浓度的标准曲线(y=0.0236+0.0077x,R2=0.992),计算样品溶液的蛋白浓度(g/L)。

1.2.3 线粒体肿胀试验 线粒体肿胀程度根据线粒体悬液在波长为540 nm处的吸光值测定[10]。制备的肝细胞线粒体按1.0 g/L重悬于线粒体悬液(125 mmol/L蔗糖,50 mmol/L KCl,2 mmol/L KH2PO4,5 mmol/L琥珀酸,5 μmol/L鱼藤酮,10 mmol/L Hepes,pH7.4),线粒体悬液分为5组:对照组、25、50、100 μmol/L AA组、RR组(阳性对照,终浓度为5 μmol/L)。对照组加入相同体积的线粒体缓冲液。30 ℃条件下孵育30 min后,各组均加入CdCl2,终浓度为10 μmol/L,加CdCl2后0～6 min记录各样品在波长为540 nm处吸光值的改变ΔA,ΔA值越大,表明线粒体肿胀度越高。以药物对线粒体肿胀的抑制率作为评判药物抗肿胀能力的指标,抑制率计算公式为:抑制率(%)=(ΔAControl-ΔADrug)/ΔAControl×100,ΔA=A0 min-A。

1.2.4 线粒体膜电位耗散的测定 按照Emaus法,使用荧光染料Rh123测定线粒体的膜电位[10]。测定时线粒体按0.5 g/L重悬于测定缓冲液(含225 mmol/L甘露醇,70 mmol/L蔗糖,5 mmol/L Hepes,pH7.2)中,按照1.2.3方法进行线粒体分组和处理后,在25 ℃条件下分别与0.3 μmol/L Rh123共孵3 min后,加10 μmol/L CdCl2损伤后,记录各组线粒体0～3 min荧光强度,测定时选用激发波长为505 nm,发射波长为534 nm。线粒体样的荧光强度增加ΔF越多,表明线粒体膜电位耗散程度越高。以药物对膜电位耗散的抑制率作为评判药物抗膜电位耗散的指标,抑制率计算公式为:抑制率(%)=(ΔFControl-ΔFDrug)/ΔFControl×100,ΔF=F-F0 min。

1.2.5 线粒体内游离钙释放的测定 用钙离子荧光指示剂Fura-2/AM测定线粒体内游离钙的浓度[10]。测定时线粒体按0.5 g/L悬浮在测定缓冲液(包括125 mmol/L蔗糖,65 mmol/L KCl,5 mmol/L Hepes,1 μmol/L Fura-2/AM,pH7.4)中,在30 ℃恒温下孵育30 min,负载Fura-2/AM的各组线粒体悬液,作相应的药物处理(同1.2.3)。在激发波长为340 nm,发射波长为510 nm条件下,记录各组线粒体加CdC12后0～3 min的荧光强度值。以线粒体悬液荧光强度的改变ΔF作为线粒体游离钙释放的指标,药物对线粒体游离钙释放的抑制率计算公式为:抑制率(%)=(ΔFControl-ΔFDrug)/ΔFControl×100,ΔF=F-F0 min。

1.2.6 Western blot方法检测线粒体Cyt c和AIF释放水平 参考1.2.3方法进行线粒体分组和处理,此5组线粒体加CdC12损伤6 min,另以对照组不作损伤处理为空白对照,收集6组线粒体上清液(冻干浓缩5倍),SDS琼脂糖凝胶电泳,转膜,振荡封闭3 h。用兔抗大鼠Cyt c抗体(1∶100稀释)和小鼠抗大鼠AIF抗体(1∶200稀释)孵育过夜。次日洗膜后,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1∶200稀释)和羊抗小鼠AIF抗体(1∶500稀释)振荡孵育2 h。洗膜,二氨基联苯胺(DAB)方法显色,凝胶成像系统进行定量分析,以灰度值反映Cyt c和AIF的释放水平[11]。

1.3 数据处理

所有实验均进行3次平行实验(n=3),使用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差分析(ANOVA),p<0.05为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 对Cd2+诱发的线粒体肿胀的影响

由图1看出,对照组肝脏线粒体中加入10 μmol/L CdCl20～6 min,线粒体悬液540 nm处吸光值不断下降表明引起了肝细胞线粒体明显的肿胀,而不同浓度AA均可以不同程度地对抗Cd2+引起的吸光值显著下降(p<0.05),表明AA能有效抑制线粒体肿胀,50、100 μmol/L AA对加Cd2+6 min诱发的线粒体肿胀的抑制率分别为42.1%和49.5%,高于25 μmol/L AA的抑制率(18.4%)(p<0.01)。

图1 AA对Cd2+诱发线粒体肿胀的影响Fig.1 Effects of AA on Cd2+-induced mitochondrail swelling

2.2 对Cd2+诱发的线粒体膜电位耗散的影响

AA对钙诱导的线粒体膜电位耗散的影响见图2。在正常肝细胞线粒体中加入10 μmol/L CdC123 min后,发现线粒体悬液中荧光强度升高了45.9%,表明Cd2+的加入引起储存在线粒体内的膜电位特异性荧光探针Rh123的释放,即诱发了线粒体膜电位的耗散。若在加Cd2+诱发膜电位下降之前将线粒体预先与一定浓度AA共孵一段时间,则可检测到,与未经AA处理的线粒体相比,其荧光强度的升高受到不同程度抑制,即膜电位耗散受到抑制。25、50和100 μmol/L AA对CdC12作用3 min引起的线粒体膜电位耗散的抑制率分别为21.7%、26.1%及41.9%(图2),其中,100 μmol/L AA的抑制率高于25和50 μmol/L AA(p<0.01)。

图2 AA对Cd2+诱发线粒体膜电位耗散的影响Fig.2 Effects of AA on Cd2+-induced dissipation of mitochondrial membrane potential

2.3 对Cd2+诱导的线粒体游离钙释放的影响

运用荧光染料Fura-2/AM检测线粒体内游离钙的释放,结果见图3。由图3可见,10 μmol/L Cd2+能引起线粒体悬液的荧光强度的明显降低(37.0%),表明Cd2+造成了线粒体内游离钙的释放。而AA预处理可以一定程度上阻断上述过程。25、50和100 μmol/L AA对Cd2+作用3 min诱发的肝脏线粒体游离钙释放的抑制率分别为27.8%、43.3%及47.9%。

图3 AA对Cd2+诱发线粒体Ca2+释放的影响Fig.3 Effect of AA on intra-mitochondrial free Ca2+ release induced by Cd2+

2.4 对Cd2+诱导的线粒体Cyt c和AIF释放的影响

由图4可见,空白对照组上清液未检测到AIF和Cyt c。由表1可知,与空白对照组相比,CdC12损伤组、各剂量AA及阳性对照RR组均出现AIF和Cyt c的释放;与CdC12组相比,各剂量AA组AIF和Cyt c释放均极显著减少(p<0.01)。表明各剂量AA处理能极显著对抗Cd2+诱导的线粒体Cyt c和AIF释放(p<0.01)。进一步比较可知,50和100 μmol/L AA组Cyt c释放水平极显著低于25 μmol/L AA组(p<0.01);50 μmol/L AA组与100 μmol/L AA组相比无显著性差异;而25、50和100 μmol/L AA 3组的AIF释放水平无显著性差异。

图4 AA对Cd2+诱发的线粒体Cyt c(A) 和AIF(B)释放的影响Fig.4 Effects of AA on mitochondrial Cyt c and AIF releases induced by Cd2+注:S代表线粒体上清液;P代表线粒体沉淀; N代表线粒体空白对照;AAL、AAM、AAH 分别代表25、50、100 μmol/L AA。

表1 各组线粒体Cyt c和AIF释放水平Table 1 Release levels of mitochondrial Cyt c and AIF

3 讨论与结论

大量证据表明,线粒体在调控细胞生存和死亡中起着决定性作用,在细胞凋亡或坏死时，线粒体发生的一系列形态和功能改变中,尤以线粒体膜通透性转运孔(PTP)的高通透性开放最为关键[13-14]。PTP为位于线粒体内外膜之间的孔道蛋白复合体,主要由外膜电压依赖性阴离子通道蛋白(VDAC)、内膜腺苷酸转位酶(ANT)和基质的亲环蛋白D组成。在病理条件下,自由基、高Ca2+等作用于线粒体PTP,PTP呈高通透性开放状态,引发线粒体高通透性转运过程(MPT)。此时,线粒体允许分子量大于1.5 kDa的物质自由进出,引起线粒体基质渗透不平衡,引发线粒体膜电位下降、线粒体肿胀,同时还伴随着线粒体内的游离钙释放,细胞色素c、凋亡诱导因子等流入胞浆,进一步诱发细胞凋亡或坏死[10,17]。而Cd2+可与线粒体内膜ANT的巯基结合,使得邻近的2个还原性的-SH 形成共价二硫键,线粒体内膜通透性显著增加,引起PTP开放,引发上述线粒体MPT过程,导致细胞死亡[8,15-16]。

潘小海[12]比较Cd2+和Ca2+诱导的肝脏线粒体MPT效应,发现肝脏线粒体对镉损伤更为敏感,Cd2+造成的线粒体肿胀效应大于Ca2+造成的肿胀效应,分析其原因可能是Cd2+不但包括Ca2+引起线粒体PTP开放途径,还有其他离子通道以及线粒体膜的结构破坏等因素参与引起线粒体肿胀效应。课题组前期研究表明,积雪草酸具有显著对抗肝损伤作用[18-19],其护肝作用可能与其线粒体活性调节有关[9-10]。本研究建立镉诱发的肝细胞线粒体MPT模型,探讨AA对镉诱发的肝细胞线粒体损伤的防护作用及其机制。结果表明,10 μmol/L Cd2+即可引起正常大鼠肝细胞线粒体产生明显肿胀、诱发线粒体膜电位耗散以及游离钙的释放,提示肝脏线粒体对镉损伤比对钙损伤更为敏感,这与前人相关研究结果相一致[12],同时,线粒体上清液出现Cyt c和AIF的释放,而25、50和100 μmol/L AA均能显著抑制Cyt c的释放水平(p<0.01),但对AIF释放水平的抑制作用不明显(p>0.05),并且随着剂量增大,抑制作用呈增强的趋势,100 μmol/L AA对Cd2+诱导的线粒体肿胀、膜电位耗散、游离钙的释放、线粒体Cyt c和AIF的释放的抑制率分别为:49.5%、41.9%、47.9%、62.2%和66.3%,表明AA能通过抑制肝细胞线粒体MPT过程,有效对抗Cd2+引起的线粒体损伤。

综上所述,AA可有效对抗Cd2+诱发的肝细胞线粒体损伤,其对肝细胞的保护作用与其抑制线粒体MPT过程、调节线粒体活性有关。该研究结果为揭示镉诱发的肝毒性机制以及AA的临床应用提供依据。