TCGA数据库中肺腺癌标志物的数据发掘研究

李 楠，迟少丽，刘 岩，王连友

目前肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是人类最常见的恶性肿瘤之一，且其发病率和病死率呈逐渐上升趋势［1，2］。肺腺癌诊断及预后方面的研究对临床治疗有重要意义。目前研究认为LUAD的发生发展是多因素、多阶段以及多基因共同改变作用的结果，其中长链非编码RNA（lncRNA）被认为发挥了重要作用［3］。lncRNA是一类长度大于200 nt的RNA分子，不编码蛋白质，可以在不同水平调控基因的表达，包括染色质修饰、转录水平以及转录后水平的调节，与人类多种疾病尤其是肿瘤密切相关［4－6］，目前已有研究发现，某些 lncRNA 在胰腺癌、直肠癌及肝细胞癌中表达明显升高［7－9］，提示其与肿瘤的发生发展密切相关，但目前关于lncRNA在肺腺癌中作为肿瘤标志物的研究较少。为此，该次研究拟通过对TCGA （The Cancer Genome Atlas）公共数据库的数据挖掘，探索其在LUAD中差异表达的lncRNAs作为LUAD肿瘤标志物的效果及指导判断预后的意临床义。

1 资料与方法

1.1 数据收集 高通量RNA－seq结果于2017年8月2日从TCGA数据库利用Bioconductor/TCGA biolink从TCGA数据库下载。利用Kaplan－Meier Plotter数据（http：//kmplot.com/analysis/）中的肺腺癌数据集进行在线生存分析。先在LUAD样本中筛选高突变频率的lncRNAs。该研究在 HGNC（www.genenames.org）数据库中搜集了265个经证实的lncRNAs，将获得的lncRNAs名称全部导入cBioPortal数据库（http：//www.cbioportal.org），在基因组和转录组层面进行变异分析，RNA表达差异Z－score阈值为±2，在所有病例中改变超过10%的lncRNAs被认为有显著性差异。再验证具有显著性差异的lncRNAs在肿瘤和正常组织中的表达差异。所有筛选出具有明显变异的lncRNAs均使用oncomine数据库（www.oncomine.org）在 LUAD和正常组织中进行转录水平的表达差异验证。若Fold change（FC）＞1.5且P值＜0.05则认为结果有统计学意义。

1.2 统计学分析 使用Graphpad prism 6.0软件进行统计学分析， 包括 t－test、heatmap、ROC 分析。生存分析采用Kaplan-Meier和log-rank检验法。P＜0.05则认为结果有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌中变异明显的lncRNAs 所有备选的lncRNAs均为出现突变的，但是，在265个lncRNA中有8个lncRNA的拷贝数和表达量的总变异率超过 10%（图 1）。 分别为 CASC8 （10%）、HCG11（10% ）、DGCR5 （11% ）、TP53TG1 （14% ）、PVT1（21% ）、PTCSC3（13%）、HAR1A （13%）及 HAR1B（10%）。

图1 基因拷贝数和mRNA差异热图

2.2 总变异率超过10%的lncRNA对肺腺癌诊断及预后价值的相关性 利用Kaplan－Meier Plotter在线数据对上述得到的8个lncRNA进行生存分析， 结果得出，PVT1、HCG11、TP53TG1 和 DGCR5高表达患者的预后低于低表达患者，且结果具有显著性差异 （P＜0.05， 图2）。 以上结果显示，PVT1、HCG11、TP53TG1和DGCR5是 LUAD预后不良因素，四者的高表达与患者生存期缩短呈显著性相关（P＜0.05）。利用Oncomine中的肺腺癌组织和正常肺组织的RNA－seq数据对上述 4个 lncRNA进行ROC分析，TP53TG1和HCG11结果无统计学意义（P＞0.05）；PVT1 和 DGCR5 AUC 分别为 0.975 （P＜0.01），0.9722（P＜0.01），说明具有良好诊断效率（图3）。综合上述结果，PVT1和DGCR5可能成为判断肺腺癌患者预后的标志物。

图2 总变异率超过10%的8个lncRNAs生存分析

图3 4个lncRNAs ROC分析

2.3 4个lncRNAs在肿瘤和正常组织中表达差异验证 利用Oncomine数据库的TCGA肺腺癌和正常 组 织 中 PVT1、HCG11、TP53TG1 和 DGCR5 的RNA－seq数据进行分析，验证其差异表达。结果显示，PVT1在LUAD组织中比正常肺癌组织升高了2.232 倍 （P＜0.01），TP53TG1 升高 1.467 （P=0.021）倍，DGCR5 升高了 1.702 倍 （P=2.24E－12）。 而HCG11没有显著性差异。笔者所在课题组将P＜0.01的作为有极显著性差异。上述结果显示，PVT1和DGCR5在LUAD组织中的表达量明显高于正常肺癌组织，且差异具有极显著性（P＜0.01）。见图4。

图4 PVT1、TP53TG1、HCG11 和 DGCR5 在正常肺组织和LUAD组织中的表达验证

2.4 PVT 1和DGCR5在其他类型肿瘤组织中的表达分析 利用Oncimne数据库对PVT1和DGCR5在29种肿瘤和正常组织中的表达数据进行分析，PVT1 在结肠腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）、肝脏肝细胞癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）、LUAD、肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、 胰 腺 癌 （pancreatic adenocarcinoma，PAAD）、直肠腺癌（rectum adenocarcinoma，READ）、胃腺癌 （stomach adenocarcinoma，STAD）、胸腺瘤（thymoma，THYM）中明显升高，在 LAML，OV，THCA中明显下降。而DECR5仅在LUAD明显上升，在LGG、PAAD和TGCT中明显下降。结果显示作为LUAD的标志物，DGCR5更具有特异性。

3 讨论

LUAD是常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康的恶性肿瘤，早期发现、诊断、治疗可以大大提高肺腺癌患者的存活率［10］。目前临床常规物理诊断很难发现＜1 cm的肿瘤，而传统的肿瘤标志物的灵敏度和特异性也不够高［11］。因此，采用现代分子生物学技术，寻找理想的肿瘤标志物对于提高恶性肿瘤诊治水平具有重大意义。近年来研究发现lncRNA具有多种生物活性，参与了X染色体沉默、染色体修饰、转录激活与抑制及RNA剪切等过程，在细胞分化、胚胎与组织发育、肿瘤中均发挥重要功能［12－14］，但 lncRNA 的数量众多，生物学功能尚不完全清楚。 Han等［15］发现，与癌旁组织相比，lncRNA GAS6－AS1（growth arrest specific gene6 antisense，RNA1）在 NSCLC组织中的表达水平显著下调。且GAS6－AS1的水平与患者淋巴结转移、肿瘤分期及预后密切相关，GAS6－AS1表达水平越低，患者生存期越短。 Zhang 等［16］通过 qRT－PCR 技术，分析 62组肺腺癌组织和邻近的癌旁组织ZXF1表达的差别，发现与邻近的正常组织相比，肺腺癌组织中ZXF1水平显著增高；进一步分析ZXF1与患者的临床病理学特征、预后之间的关系，发现ZXF1表达上调与淋巴结的转移、肿瘤的病理分期以及淋巴结转移的范围有关。这说明，长链非编码RNA在肺腺癌中呈现高表达，并且在肿瘤细胞增殖和侵袭中发挥重要作用。

lncRNA在肺癌的发生、发展和耐药过程中有重要的调控作用，这些lncRNA部分发挥致癌作用，因此，加深加快对lncRNA在肿瘤发生发展过程中的机制研究有助于对肺癌的早期诊断及预后判断。在该次研究中，利用TCGA数据库对肺腺癌中lncRNA进行挖掘，发现8个在基因拷贝数和表达差异超过10%的lncRNA，并利用在线数据分析其在肺腺癌诊断和预后判断中的临床价值，找到了PVT1和DRCG5两个较大临床价值的lncRNA，通过两种分子在LUAD表达的验证和其他肿瘤类型中表达分析，确定DGCR5可以作为特异的对LUAD进行诊断和判断预后的指标，为临床肿瘤标记物的筛选建立提供了研究依据。