丹溪痛风胶囊对胶原诱导性关节炎大鼠RORγt和Foxp3蛋白表达的影响＊

韩玉生，李东东，侯志涛，朴成玉，周忠光

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种临床常见自身免疫性疾病，主要由于炎症引起关节滑膜、软骨和骨质破坏，近期研究发现RA的发生发展与Th17和Treg细胞密切相关［1］。丹溪痛风胶囊组方来源于《丹溪心法》中所载的上中下痛风方，现代临床上应用于类风湿性关节炎的治疗，取得了良好治疗效果［2］。该研究在2015年8月—12月进行，选取30只SD大鼠，通过CIA大鼠模型，观察丹溪痛风胶囊对脾组织淋巴细胞中RORγt和Foxp3蛋白表达的影响，为临床应用开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 30只雄性清洁级SD大鼠，体质量（250±20）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK鲁20140001。在安静环境下适应性饲养1 W，室温（22±2）℃，相对湿度55%～60%。给予充足清洁饮水，自由摄食。

1.1.2 药物与试剂 丹溪痛风胶囊由苍术、黄檗、防己、威灵仙、制南星、泽泻、车前子各15 g，川芎、桃仁、红花、羌活、桂枝各10 g，土茯苓25 g，萆薢20 g组成，0.5 g/粒，由黑龙江中医药大学实验中心提供；牛Ⅱ型胶原蛋白与弗氏不完全佐剂（IFA）购自美国sigma公司；兔抗大鼠RORγt和Foxp3多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司；蛋白抽提试剂、BCA蛋白定量试剂盒等试剂均由赛诺博公司提供；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂由Roche提供；山羊抗兔 IgG（H+L），HRP、山羊抗小鼠 IgG（H+L），GAPDH鼠单抗由天德悦公司提供。

1.1.3 主要仪器 MultiSkan3酶标仪 （Thermo），垂直电泳仪、湿转电泳槽（北京六一），水平脱色摇床（其林贝尔），凝胶成像系统 （以色列MiniLumi公司），低温冷冻离心机（上海安亭）；电子天平（梅特勒公司），大鼠足趾肿胀仪（成都泰盟）。

1.2 方 法

1.2.1 模型制作 采用牛Ⅱ型胶原蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混合方法制备CIA造模剂，在大鼠尾根部、背部、右后肢足趾皮内注射，0.4 ml/只。在首次注射后的第21天时按上述方法再注射0.2 ml/只进行免疫加强。通过观测大鼠足趾肿胀度和关节炎指数来评价模型是否成功。

1.2.2 分组及给药 CIA模型制备成功大鼠随机分为3组：模型组、丹溪痛风胶囊组，另选取正常大鼠作为对照，每组10例。采用灌胃进行治疗，丹溪痛风胶囊组给药剂量通过前期实验结果确定为6.4 g/kg；正常组和模型组均给予等容积的生理盐水。各组大鼠连续给药28 d。

1.2.3 观察指标

1.2.3.1 大鼠足趾肿胀度和关节炎指数 在造模前、后和治疗后分别检测各组大鼠左、右后足跖的容积，并计算其平均足跖容积，分析足趾肿胀度。分别在造模后和治疗后根据大鼠关节红肿程度、范围和关节肿大变形情况，采用关节炎指数积分法进行测定。

1.2.3.2 脾组织淋巴细胞中RORγt和Foxp3蛋白表达 末次给药后4 h，处死大鼠，无菌条件下取脾去掉多余的脂肪组织，称取一定量的脾组织放入200目钢网中，加入一定量PBS反复碾磨制备淋巴细胞单细胞悬液。4℃，1700 r/min离心5min，弃上清。Western blot技术检测RORγt和Foxp3蛋白表达。

1.3 统计学分析 应用SPSS 18.0软件包进行统计分析，实验数据均以x±s表示。采用单因素方差分析，组间比较t检验，方差齐，用LSD检验；方差不齐，用Dennett’s检验；以P＜0.05差异有统计学意义。

表1 丹溪痛风胶囊对RA大鼠足趾肿胀度和关节炎指数的影响（±s，n=10）

表1 丹溪痛风胶囊对RA大鼠足趾肿胀度和关节炎指数的影响（±s，n=10）

注：与对照组比较，△P＜0.01；与模型组相比较，★P＜0.01。

关节炎指数造模21 d 治疗28 d 造模21 d 治疗28 d对照组 1.82±0.75 4.78±0.81 0.64±0.35 0.78±0.31模型组 16.39±3.15△ 15.27±3.42△ 8.19±0.64△ 8.75±1.72△丹溪痛风胶囊组 16.89±4.15△★ 6.56±2.14★△ 8.45±0.81△ 2.54±0.82★△组别 足趾肿胀度

2 结果

2.1 各组大鼠足趾肿胀度和关节炎指数 与对照组相比较，造模21 d时各组大鼠、治疗28 d模型组大鼠足趾肿胀度和关节炎指数明显增加，P＜0.01，差异有统计学意义；与模型组相比较，丹溪痛风胶囊组大鼠足趾肿胀度和关节炎指数明显减少，P＜0.01，差异有统计学意义。结果见表1。

2.2 各组大鼠脾中RORγt和Foxp3蛋白表达与对照组比较，模型组大鼠血清中RORγt和Foxp3水平明显升高，P＜0.01，差异有统计学意义；与模型组比较，丹溪痛风胶囊组大鼠血清中RORγt和Foxp3水平明显降低，P＜0.01，差异有统计学意义。结果见表2。

表2 丹溪痛风胶囊对RA大鼠脾中RORγt和 Foxp3 蛋白表达的影响（±s，n=6）

表2 丹溪痛风胶囊对RA大鼠脾中RORγt和 Foxp3 蛋白表达的影响（±s，n=6）

注：与对照组比较，△P＜0.01；与模型组相比较，★P＜0.01。

组别 RORγt Foxp3 RORγt/Foxp3对照组 0.452±0.048 1.585±0.039 0.285模型组 1.724±0.067△ 0.418±0.043△ 4.12丹溪痛风胶囊组 0.621±0.073★△ 0.976±0.067★△ 0.62

3 讨论

CD4+T细胞是机体免疫系统中重要的组成部分，Th17和Treg细胞是CD4+T细胞的两个亚群，近年来研究认为Th17/Treg细胞失衡与RA发生发展的进程密切相关。RORγt和Foxp3分别是Th17和Treg细胞的特异性转录因子，RORγt表达增多能促进Th17细胞分化和IL－17的分泌，促进RA炎症级联反应的发生与发展［3－5］，Foxp3 可促进抑制性细胞因子IL－10、TGF－β等分泌，具有抗炎和对免疫负性调节功能［6］。因此RORγt/Foxp3平衡能决定初始T细胞受抗原刺激后向Th17或Treg方向分化，从根本上影响到Th17/Treg的平衡。

临床研究表明，类风湿性关节炎患者外周血RORγt水平明显升高，Foxp3水平明显降低，RORγt/Foxp3比值明显增加。川芎嗪能明显下调外周血 RORγt水平，降低 IL－17，升高 Foxp3 水平，提高类风湿性关节炎患者免疫功能，从而减轻炎症反应，改善患者临床症状及不良预后［7］。相关的实验研究表明，Treg细胞及其转录因子Foxp3表达量在Ⅱ型胶原蛋白诱导性关节炎小鼠淋巴细胞中均明显升高，其动态变化与RA进展关系密切［8］。薏苡仁酯能上调CIA小鼠外周血中Foxp3+CD4+CD25+Treg比例，通过免疫调节对RA起到治疗作用［9］。薯蓣皂苷能显著降低胶原诱导型关节炎小鼠淋巴细胞中RORγtmRNA水平，升高Foxp3mRNA 水平，通过调节Th17/Treg细胞平衡而对RA起到治疗作用［10］。

该研结果表明，CIA大鼠脾组织淋巴细胞中RORγt蛋白表达明显升高，Foxp3蛋白表达明显降低，分别为 1.724±0.067 和 0.418±0.043。丹溪痛风胶囊治疗后，RORγt蛋白表达明显降低，而Foxp3蛋白表达明显升高，分别为0.621±0.073和0.976±0.067。丹溪痛风胶囊通过调节Th17和Treg细胞特异性表达转录因子RORγt、Foxp3蛋白表达的平衡，抑制CIA大鼠关节及滑膜炎症的进程，从而达到治疗RA作用。