温度对小球藻和铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光特性的影响

马 欠，邓春暖，郭锋锋

(云南师范大学 a.旅游与地理科学学院，b.云南省高原湖泊生态与全球变化重点实验室,昆明 650500)

研究水体藻类外界环境的变化对如何避免或减轻有害“水华”的发生具有重要的指导意义。温度是决定微藻生长的重要环境因子，是影响微藻细胞生长、细胞内生物大分子组成和含量的重要因素，也是影响水生植物生长、繁殖、种群演替的一种关键生态因素。适宜的温度是快速水华生长的必要条件，也是优势种发生更替的重要环境因子。研究温度对微藻生长的影响对湖泊污染治理提供理论基础有着重要作用。光照是藻类主要能量来源，合适的光照会对微藻的生长产生积极作用，光照过强或过弱都会对微藻产生抑制作用。陈宇炜等[1]提出气候变化(主要是光照、温度变化)等对藻类的组成和演替产生非常重要的影响。晁建颖等[2]认为温度是决定生态的一个极其重要的因子，例如绿藻仅适宜在较低温度下增值，绿藻在较低温度时有较强的竞争优势，蓝藻在较高温度时有竞争优势。EPPLEY等[3-4]对多个藻种进行调查，在大量试验研究的基础上，得到藻类增殖速率和温度关系的经验公式。铜绿微囊藻(Microcystis Aeruginosa)，蓝藻门微囊藻属，是光合自养型生物，具有很强的光合作用能力，且铜绿微囊藻生长周期短，不分层，易于培养，对外界敏感性强。小球藻(Chlorella ),绿藻门绿藻纲，是单细胞藻，对生长环境要求简单，适应性较强，在海洋、淡水等区域分布较广。自然水体中藻的种类和数量会根据季节的变化发生相应的改变，一般在晚春和初夏水体中绿藻易形成优势种，而在夏天和初秋随着温度的升高，蓝藻的数量会逐渐增加，并成为优势种，但数量过高会导致蓝藻水华的爆发。因此，研究微藻生长的环境条件，对于水环境污染和治理有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用的藻种铜绿微囊藻(Microcystis Aeruginosa FACHB905)和小球藻(Chlorella)均购自中国科学院水生生物所淡水种库。培养基采用BG-11培养基[5]，培养条件为25℃，t(光)t(暗)=12h12h，光照为8000lx。试验所用的玻璃器皿均用稀盐酸浸泡30min，用无菌水冲洗3次，再用灭菌锅于121℃灭菌20min，烘干备用。

1.2 试验仪器

PQX-250人工气候箱：上海海向仪器设备厂，控温精度±1℃，光照度0～12000lx；YM75立式蒸汽灭菌锅：国产；UV2800紫外分光光度计：上海Unico公司；FL3500叶绿素荧光仪：PSI,捷克；普通血球计数板和三角瓶(高温灭菌)等。

1.3 试验方法

试验藻种经过驯化培养后，达到试验所需浓度，选用长势较好的藻种在不同温度下培养，控制温度分别为10℃，14℃，18℃，22℃，26℃，光照为6000lx，pH为8，每个处理组设3个平行样。试验微藻的初始密度设置OD680为0.05(±0.001)。每天摇晃试验藻3次以上，并随机更换位置，使藻液均匀接受光照。

1.4 测定和计数方法

1.4.1 OD680测定

每天定时取铜绿微囊藻藻液1次，吸取2.5 mL放入比色皿中，紫外分光光度计测量OD680值。空白校准用BG-11营养液。

1.4.2 叶绿素荧光参数的测定

用叶绿素荧光仪测量微藻的叶绿素荧光参数，在测量之前各个处理样品需要暗适应5 min。

叶绿素荧光技术是一种以光合作用理论为基础，利用生物体内叶绿素研究和探测光合生理状况以及外界环境对其细微影响的活体测定技术。叶绿素荧光动力学技术是用于评鉴作物耐受逆境能力的一项热门技术，被称为测定环境胁迫下光合功能和器官状态的响应快速、无损伤的探针。[6-7]

1.4.3 细胞计数

采用一般的计数方法，用血球计数板计数。用血球计数板专用盖玻片，每天同样的时间取样计数，整个取样过程均在无菌条件下进行。准备好洁净的计数板，盖上盖玻片，用液枪取1mL藻液从盖玻片边缘慢慢渗入，避免产生气泡，并用吸水纸吸走多余的藻液，每个样品计数两次，如果误差大于15%，需要重新取样计数，求最终的平均数。

比生长速率计算公式[8]为

式中：X2为某时间间隔终结时的藻类现存量；X1为某一时间间隔开始时的藻类现存量；T2-T1为某一时间间隔。

1.5 数据处理分析

应用SPSS20.0软件对数据进行分析和统计，用origin 9.0绘图。

2 结果与分析

2.1 温度对小球藻和铜绿微囊藻吸光度值(OD680)的影响

不同温度(10℃～26℃)对小球藻和铜绿微囊藻吸光度值(OD680)的影响见图1。从图可知小球藻比铜绿微囊藻更耐低温，而铜绿微囊藻更喜高温。温度对小球藻OD680的影响如图1(a)，当温度为10℃时，前7天小球藻基本停止生长，7天以后小球藻可能适应较冷的环境，有一个缓慢上升的过程。在10℃时小球藻还能继续生长，说明10℃并没有到达小球藻耐受最冷温度值。温度到达14℃以上，小球藻OD680值呈快速上升的趋势，说明小球藻在14℃以上时能够迅速生长。26℃时小球藻生长最快，但14℃以上也能够快速生长，并且14℃，18℃，22℃，26℃时小球藻的OD680值上升的趋势是一致的，说明小球藻能够适应较低的温度。通过单因子方差分析可知，14℃时小球藻OD680的值与18℃，22℃，26℃时小球藻OD680的值存在显著性差异(P<0.05)，通过不同温度和小球藻OD680值相关性比较分析可知，温度和小球藻OD680的值存在显著性差异(P<0.05)，说明温度对小球藻生长的影响呈正相关，在14℃～26℃温度越高越能刺激小球藻的生长。

不同温度对铜绿微囊藻OD680的影响如图1(b)。温度对铜绿微囊藻OD680的影响比较明显，温度与铜绿微囊藻OD680的变化呈正相关关系，且铜绿微囊藻比小球藻更不能耐受寒冷，当温度低于14℃时，铜绿微囊藻OD680值明显呈下降趋势，说明铜铝微藻在低于14℃环境下生长明显受到抑制。当温度高于18℃时，温度越高铜绿微囊藻OD680值越高，铜绿微囊藻OD680与温度呈正比关系，说明铜绿微囊藻是喜热的一种蓝藻。通过单因素方差分析可知，10℃时铜绿微囊藻OD680值与18℃，22℃，26℃时铜绿微囊藻OD680值有显著性差异(P<0.05)。从图1(c)可知，当温度大于22℃时，小球藻OD680值大于铜绿微囊藻OD680值，当温度高于22℃时，小球藻OD680值低于铜绿微囊藻OD680值，说明小球藻更耐较低的温度，而铜绿微囊藻在较高温度生长的更好。

图1 不同温度下两种藻的OD值(OD680)的变化

2.2 不同温度下小球藻和铜绿微囊藻藻细胞的生长特征

不同温度小球藻和铜绿微囊藻藻生长情况见图2，其特征生长速率如图3所示。小球藻藻细胞的数量与温度有关，温度越高，小球藻生长的越好，但是在同样的温度条件下(22℃和26℃)铜绿微囊藻比小球藻生长的好，而在相对低温情况下(14℃和10℃)，小球藻比铜绿微囊藻生长得好。说明小球藻比铜绿微囊藻更耐低温，而铜绿微囊藻比小球藻更喜高温。由此可以判断以铜绿微囊藻为代表的蓝藻在湖泊、河流和海洋中夏季生长得更好，也就是夏季更容易爆发蓝藻；以小球藻为代表的绿藻在晚春和初夏生长得更好，绿藻会在蓝藻之前爆发。两种藻的比生长速率(第9天)如图3，小球藻在低温(10℃)时的比生长速率依然为正，说明小球藻在低温时依然能够生长，只是生长得比较缓慢，而铜绿微囊藻在低温(10℃和14℃)时，比生长速率为负，说明铜绿微囊藻在低温时生长基本停滞，在高温时生长得更好。

通过单因素方差分析可知，小球藻在10℃ 时的藻细胞密度生长值与14℃,22℃时的藻细胞生长值存在显著性差异(P<0.05),与26℃ 的显著性差异更明显(P<0.01)，说明温度对小球藻生长的影响很大。通过温度与藻细胞生长数量的相关性分析可知，温度与细胞生长数量相关性非常显著，说明温度与细胞数量存在明显的正相关关系。通过单因素方差分析可知，铜绿微囊藻在10℃ 的藻细胞数量与18℃,22℃,26℃的藻数量存在显著性差异(P<0.05),而14℃的藻细胞数量与18℃,22℃,26℃的藻细胞数量也存在显著性差异(P<0.05)。通过温度和藻细胞数量的相关性分析可知，温度和藻细胞数量相关性存在明显的正相关关系。通过两种藻生长曲线分析可知，在试验温度的范围内，温度与藻生长情况相关。

图2 不同温度条件下小球藻和铜绿微囊藻的生长曲线

图3 不同温度条件下小球藻和铜绿微囊藻第9天的比生长速率的变化

2.3 不通温度下小球藻和铜绿微囊藻PSⅡ的最大光化学量子产量Fv/Fm

不同温度对小球藻和铜绿微囊藻叶绿素荧光的影响如图4，小球藻在26℃时，其最大光化学量子产量(Fv/Fm)处于平稳上升的趋势，且值相对较大，10℃时小球藻的Fv/Fm相对最小，但表现出缓慢上升的趋势，说明较低温度时小球藻仍可以继续生长。铜绿微囊藻的Fv/Fm根据温度的不同，其变化趋势更明显，当温度为10℃和14℃时，铜绿微囊藻的Fv/Fm呈下降趋势，且温度越低下降越明显。当温度较高(22℃，26℃)时铜绿微囊藻Fv/Fm表现出平稳较高的状态，说明较低温度能够抑制铜绿微囊藻的生长，较高温度更能促进铜绿微囊藻的生长。

图4 两种藻在不同温度条件下的最大化学量子产量(Fv/Fm)的变化

温度是影响生物生长的重要因素之一，对生物体内细胞酶的活性及生化反应的速率具有重要影响。[9]温度是藻类进行光合作用的影响因子，通过控制光合作用的酶促反应或呼吸作用，直接影响浮游植物的生长繁殖。温度是影响藻类生长繁殖的一个关键环境因子，适宜的温度是微藻迅速生长繁殖的条件。许多研究表明[10-12]，温度对藻类的生长影响比较显著，高于光照、pH等环境因素，温度对不同的藻类生长的影响有所差异。

3 结论

本试验控制光照和pH，研究温度对小球藻生长的影响，结果表明，温度对小球藻和铜绿微囊藻生长的影响有差异。当温度为10℃时，小球藻生长缓慢，而铜绿微囊藻生长基本停止甚至死亡。小球藻在10℃以上随着温度的上升其生长速度迅速，30℃是小球藻的最适宜温度。不同研究者的研究结果各有不同,可能是培养基不同或控制的光照、pH不同所致。

1)小球藻最适宜的生长温度为26℃。小球藻在低温10℃也能继续生长，说明小球藻能够耐受低温，更容易生长在春季的水环境中。

2)铜绿微囊藻最适宜的温度也为26℃。铜绿微囊藻在10℃和14℃的相对低温时，生长表现停滞甚至死亡，说明铜绿微囊藻更喜高温，容易生长在夏季的水环境中。