多指标综合评分法对强筋接骨胶囊提取工艺参数的优化研究*

廖 芳 ，王 欢 ，谭天林 ，陈纬别 ，马书军 ，张 丹

1成都市新都区中医医院，四川 成都 610500；2西南医科大学

医疗机构制剂是新药研发的摇篮，是市售药品的补充，在临床治疗中发挥非常重要的作用。但医疗机构制剂常存在工艺研究粗糙，生产质量可控性较差等缺点。强筋接骨胶囊是我院名中医兰宗焕主任医师的临床经验方，功效为强筋接骨，散瘀止痛，临床常用于跌打损伤所致的局部疼痛、瘀肿。方中骨碎补苦、温，补肾强骨，续伤止痛为君药；川芎辛、温，活血行气，祛风止痛；当归甘、辛、苦、温，补血、活血，二者共为臣药。该制剂在我院临床应用十余年，疗效显著。现拟对该制剂的提取工艺进行进一步研究，拟采用多指标评价正交试验法对该制剂提取工艺参数进行优化，以提升该制剂的质量控制标准。

1 试药与仪器

1.1 药材及试剂 药材购自四川民康药业有限公司；对照品柚皮苷(批号：110722-201312)、阿魏酸(批号：110773-201313)均购自中国食品药品检定研究院，甲醇、乙腈为色谱纯(昌泰兴业有限公司)；水为反渗透纯化水。

1.2 仪器 Agilent Tcehnologies 1260高效液相色谱仪(G1311C四元泵，G4212B检测器，G1316A柱温箱)；色谱柱为Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；AB204-N 型电子分析天平(梅特勒 -托利多仪器上海有限公司)；DL-360型超声波清洗剂(浙江象山县石浦海天电子仪器厂)；TC-15型套式恒温器(海宁市新华医疗器械厂)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件选择 参考文献［1］，当归、川芎的代表性成分阿魏酸及骨碎补代表性成分柚皮苷的流动相中均有甲醇、醋酸溶液，因此，试验中以一定比例的甲醇、4%的醋酸水溶液为流动相，柱温35℃，同时检测柚皮苷和阿魏酸。

以 Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)为固定相，283 nm、321 nm为检测波长，柱温35℃，比较以下流动相系统。见图1。1)甲醇∶4%醋酸水 =19∶81；2)甲醇∶4%醋酸水 =20∶80；3)甲醇∶4%醋酸水 =22∶78；4)甲醇∶4%醋酸水 =23∶77；5)甲醇∶乙腈∶4%醋酸水 =15∶5∶80；6)甲醇∶乙腈∶4%醋酸水 =16∶4∶80

图1 不同溶剂系统HPLC分离图谱

结果显示，系统4)5)6)均有较好的分离度，较好的峰型，经过反复验证，结合《中医药典》方法，确定此次工艺优化液相检测条件为：以甲醇∶乙腈∶4%醋酸水 =16∶4∶80 为流动相，检测波长为321 nm和283 nm，柱温35℃，流速1 mL/min。

2.2 对照品溶液的制备［2-3］柚皮苷对照品溶液制备：取柚皮苷对照品0.012 0 g，精密称定，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷240 μg的溶液。阿魏酸对照品溶液制备：取阿魏酸对照品0.010 0 g，精密称定，加甲醇制成每1 mL含阿魏酸400 μg的溶液。

2.3 线性关系的考察［4-5］精密吸取柚皮苷对照品溶液 0.125、0.625、1.25、2.5、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度；精密吸取阿魏酸对照品溶液 0.25、1.25、2.5、5.0、10.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度。

分别吸取上述对照品溶液各10 μL，以甲醇∶乙腈∶4%醋酸水 =16∶4∶80 为流动相，柱温 35℃，检测波长为283、321 nm，流速1 mL/min的色谱条件进行测定，以峰面积积分值(Y)对进样量(X，μg)进行线性回归，得回归方程。结果见表1。

表1 直线回归方程与线性范围

2.4 精密度考察 取同一供试品溶液10 μL，按上述色谱条件重复进样6次，记录其峰面积并计算其RSD，结果表明仪器精密度好。见表2。

2.5 稳定性考察 精密吸取供试品溶液10 μL，在上述色谱条件下，分别于 0、2、4、8、12、24、48、72小时进行进样，记录峰面积，计算RSD。结果分析表明，供试品溶液在24小时内稳定。见表3。

表2 精密度实验

表3 稳定性实验

2.6 提取工艺优化

2.6.1 正交实验 为了优化提取工艺，依据预实验及处方配比，称取620 g药材，选择提取倍量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)3个因素，每个因素3个水平，按L(34)正交表安排实验(提取溶媒为水)。实验安排表见表4，结果见表5—6。

表4 正交实验因素水平表

表5 正交实验结果表

表6 方差分析结果

由表6方差分析得出：影响因素大小为C＞A＞B，提取次数(C)对提取工艺有显著影响，直观分析最佳方案为A3B3C3，但经方差分析可知加水量和提取时间各水平间无明显区别，提取次数2、3水平之间无明显差异。从节约能源，降低成本的角度出发，故将 A3调整为 A1，B3调整为 B1，C3调整为C2，即 A1B1C2，加水量为 6 倍水，提取时间为 60 min，提取次数为2次。

2.6.2 正交结果验证 为了进一步验证上述优选实验方案的可行性和稳定性，称取同样处方量，按上述较佳实验方案进行实验验证，平行3份。见表7。

表7 验证实验结果

按选定的提取方法进行验证试验，结果显示3个评定指标较正交试验中组分偏高表明该提取方法稳定可行。

3 讨论

在含量测定中，《中国药典》所载方法，是针对单一成分，在实际操作过程中，重复操作繁杂，工作量大。参考相关文献［6-10］。本实验将方中3味药材的代表性成分柚皮苷、阿魏酸在同一溶剂系统下进行含量测定，分离度较好，峰形佳，优化该工艺中液相检测条件，减少操作步骤，降低了工作量。

3.1 检测波长的确定 本试验采VWD紫外检测器，在321 nm检测阿魏酸，在283 nm检测柚皮苷，检测波长设定为各成分的最大吸收处，使上述2种成分均有最大的相应，便于对各组分的含量进行准确测定。

3.2 参考文献显示，同时测定多种成分，需要梯度洗脱 本实验通过对流动相的反复预实验，未采用梯度洗脱的方法，实现以甲醇∶乙腈∶4%醋酸水=16∶4∶80 为流动相时，阿魏酸在 283 nm 及柚皮苷在321 nm处基线平稳，均有较好的分离度，较好的峰型，灵敏度高。