山东地区新型鸭呼肠孤病毒致病特点与变异分析

于可响，路 晓，刘存霞，高月花，亓丽红，宋玲玲，李玉峰，宋敏训

（山东省农科院家禽研究所禽病研究中心 山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室，济南 250023）

新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）主要引起雏鸭肝脾出血和坏死，临床上称之为“鸭新肝病”、“鸭白点病”、“鸭出血性坏死性肝炎”、“鸭脾坏死病”等。之所以称之为“新型呼肠孤病毒病”，因为该新型鸭呼肠孤病毒在血清学上完全不同于之前的“番鸭呼肠孤病毒”[1-3]。2005年前后该病先在我国南方一些省份，如福建省、广东省、浙江省等鸭群中开始出现，后蔓延至全国主要养鸭区。该病一年四季均能发生，不同品种的鸭均可发病，如樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭、半番鸭等；发病日龄一般为3～25日龄，其中以5～10日龄居多，病程5～7 d，发病率5%～35%，死亡率2%～20%，一般发病鸭日龄愈小，发病率和死亡率愈高[4-7]。

2011年新型鸭呼肠孤病在山东地区开始发生，之后几年呈现区域性流行，发病率较低，但从2017年开始该病的发病率迅速上升，发病区域也不断扩大，给山东省的肉鸭养殖造成了很大的困扰。本研究将2011年～2018年从山东地区分离到的8株新型鸭呼肠孤病毒的毒力、致病性及主要抗原基因的变异进行了分析，以期了解该病毒的变异情况，为该病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 8株新型鸭呼肠孤病毒分离自山东地区2011年～2018年间的发病鸭群中，具体背景信息见表1。

表1 8株新型鸭呼肠孤病毒分离株的背景信息Table 1 Information of 8 NDRV isolates

1.1.2 鸭胚与雏鸭 SPF鸭胚由山东省昊泰动物繁育公司提供；1日龄健康樱桃谷鸭购自山东省德州市某种鸭场。

1.1.3 试剂 一步法RT-PCR试剂盒、感受态细胞DH5α购自北京康润诚业生物科技有限公司；M-MLV反转录酶、RNasin、dNTP、LA Taq酶、pMD18-T载体试剂盒购自TaKaRa（大连）公司；RNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自AXYGEN公司；DMEM、犊牛血清购自GIBCO公司；谷胺酰胺购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 对鸭胚的致病性 将不同毒株的第3代鸭胚毒分别用生理盐水做10倍系列稀释，取10-3～10-75个稀释度经尿囊腔接种10日龄鸭胚，0.1 mL/枚，每个稀释度接种5枚，观察鸭胚死亡情况及死亡鸭胚的病变情况，观察至接种后的d 6。按Reed-Muench法计算病毒的鸭胚半数致死量（embryo lethal dose，ELD50）。

1.2.2 对鸭胚成纤维细胞（duck embryo fibroblast，DEF）的致病性 将不同毒株的第3代DEF培养上清分别用含2%小牛血清的DMEM培养液做10倍系列稀释，取10-3～10-86个稀释度接种铺满DEF的96孔细胞板，200 μL/孔，每个稀释度接种8孔，同时设正常细胞对照。放37℃、5% CO2培养箱中继续培养，每天观察细胞，记录细胞病变情况，直至接种后96 h，按Reed-Muench法计算病毒的细胞半数感染量（tissue culture infective dose，TCID50）。

1.2.3 对雏鸭的致病性 将不同毒株的第3代鸭胚毒分别用生理盐水稀释至104ELD50/0.1mL，皮下接种1日龄健康樱桃谷鸭，0.1 mL/只，每个毒株接种10只，观察雏鸭死亡情况，攻毒后d 6剖杀试验鸭，观察脾脏病变情况。

1.2.4 抗原基因（σC）克隆测序 参照GenBank中发表的新型鸭呼肠孤病毒S1基因序列（GenBank登录号：KJ879930）设计1对引物。上游引物P1：5'-CGAGTATCTTTGTACGCTACG-3'；下游引物P2：5'-CTCATCGCGCGCCACAG-3'，预期扩增片段大小为1021 bp，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。按照RNA提取试剂盒说明提取病毒RNA，利用上述引物，按照一步法RT-PCR试剂盒的说明进行扩增。按照DNA凝胶回收试剂盒说明回收PCR产物，与pMD18-T载体连接后，转化DH5α。挑菌提取质粒，分别进行PCR和酶切鉴定，鉴定为阳性的菌落送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序，并进行序列比对分析。

1.2.5 σC蛋白基因进化分析 利用DNAStar软件，对这8株病毒的σC蛋白核苷酸和氨基酸序列分别进行比对；利用MEGA软件，将从GenBank中选取的有代表性的新型鸭呼肠孤病毒毒株同这8株病毒一起绘制σC蛋白基因的遗传进化树。

2 结果

2.1 8株新型鸭呼肠孤病毒对鸭胚的致病性 将8株新型鸭呼肠孤病毒接种鸭胚，均导致鸭胚死亡，死亡鸭胚通身出血，死亡时间为72～96 h，并将这8株病毒接种10日龄鸭胚，测定他们病毒效价，结果见表2。

2.2 8株新型鸭呼肠孤病毒对DEF细胞的致病性 将8株新型鸭呼肠孤病毒接种DEF细胞，细胞病变情况一致，初期形成合胞体，然后细胞拉网并逐渐脱落。在DEF细胞上测定第3代CEF上清中的病毒滴度，结果见表3。

2.3 8株新型鸭呼肠孤病毒对雏鸭的致病性 将这8株病毒分别回归1日龄健康樱桃谷鸭，结果都能复制出相同的症状与病变，表现为精神不佳、食欲不振，剖检发现脾脏均出现肿大、坏死、变硬现象（图1），死亡率为0%～20%（表4）。

2.4 σC蛋白基因克隆测序 分别提取8株病毒的RNA，进行一步法RT-PCR，结果均扩增到大小1 kb左右的条带，与预期相符（图2）。将获得的基因序列提交到GenBank中进行比对，发现均为新型鸭呼肠孤病毒σC基因序列。

图1 新型鸭呼肠孤病毒接种雏鸭脾脏病变Fig.1 Splenic lesions of ducks attaced by novel duck reovirus

图2 新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白基因扩增Fig.2 Amplification of σC genes of Novel duck reovirus

表2 8株新型鸭呼肠孤病毒的ELD50Table 2 ELD50 of 8 NDRV isolates

表3 8株新型鸭呼肠孤病毒的TCID50Table 3 TCID50 of 8 NDRV isolates

表4 攻毒实验鸭死亡情况Table 4 Mortality statistics of experimental ducks attacked

2.5 σC蛋白基因进化分析 利用DNAStar软件，对这8株病毒的σC蛋白核苷酸和氨基酸序列分别进行比对，发现它们的核苷酸同源性为94.5%～99.6%，氨基酸同源性为95.0%～99.4%，早期分离株与新近分离株同源性相对较低（表5）。利用MEGA软件，将这8株病毒和Genbank中有代表性的毒株进行σC蛋白基因遗传进化分析，结果发现，山东地方分离株处于一个单独的分支。这8株山东地方分离株σC蛋白基因的遗传进化与其分离时间有着密切的相关性（图3）。

表5 8株新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白核苷酸和氨基酸同源性比对（%）Table 5 Comparison between the nucleotide and amino acid sequences of the σC proteins of 8 NDRV isolates（%）

图3 新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白基因的遗传进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of σC genes of NDRV isolates

3 讨论

近几年，新型鸭呼肠孤病毒病的流行区域已从南方扩散到北方，发病率也在不断上升，已成为影响我国养鸭业发展的重要疾病之一。该病主要导致雏鸭肝脾出血和坏死，死亡率不高，但严重影响肉鸭的生长发育和免疫力，容易激发细菌感染，给肉鸭养殖造成了很大的困扰[8-10]。

2011年该病在山东地区开始流行，并呈现日益严重的趋势。为了搞清楚该病毒近几年在山东地区的变异情况，我们将从2011～2018年山东地区分离到的8株新型鸭呼肠孤病毒进行了毒力、致病性及主要抗原σC蛋白的变异分析。致病性试验发现，这些毒株均能致死鸭胚，死亡鸭胚通身出血；DEF细胞初期形成合胞体，然后细胞拉网并逐渐脱落；攻毒1日龄健康雏鸭均出现脾坏死病变，且死亡率较低。这些结果说明，新型呼肠孤病毒从山东地区开始出现至今，其致病性未发生改变。这8株病毒在鸭胚病毒效价为10-5.00～10-6.00/0.1 mL，在鸭胚成纤维细胞的病毒效价为10-5.33～10-6.30/0.1 mL，这说明不同毒株的病毒效价存在一定的差异。我们对这些毒株的主要抗原σC蛋白基因进行了克隆、测序，发现他们的核苷酸长度均为966 bp，通过对σC蛋白基因的遗传进化树分析发现，山东地方分离株与国内其他地区分离株（主要是南方地区）存在较为明显的差异，处于一个独立的分支，并且不同山东分离株之间也存在较为明显的时间差异。

通过对山东地区新型鸭呼肠孤病毒的毒力、致病性及主要抗原σC蛋白的变异分析，我们发现该病毒致病性未发生明显的变化，但抗原基因与国内其他地区分离株相比有较大的差异，并且山东地区分离株也在不断发生着变异，因此需要引起疫苗研发和疾病防控工作者的足够重视。