农村有机生活垃圾沼气发酵工艺优化及菌群分析

魏珞宇， 罗臣乾， 张 敏， 施国中， 张国治

(农业部沼气科学研究所， 成都 610041)

近年来，随着农村经济的发展，农民生活水平的提高，农村生活垃圾的数量已经达到了每年3亿吨[1]。根据调查，中国农村生活垃圾主要组分包括厨余类、灰土类、橡塑类和纸类。而在厨余类主要包括剩菜叶、剩果皮、蛋壳、骨头以及剩饭等。根据文献研究所得，除东北地区外，我国大部分农村生活垃圾中，厨余类垃圾占超过40%[2]。该部分垃圾有机质含量高，尤其是糖类物质含量高，并且含有氮、磷、钾、钙及微量元素[3]。以往，该类生活垃圾通常是用来当做家庭饲养家禽及牲畜的饲料或者用于田间堆肥[4]。随着农村生产生活方式的转变，失去了就地消纳该类垃圾的能力。该部分垃圾随其他生活垃圾被农户丢弃于户外。在一些经济农村条件较好的农村，设有生活垃圾集中收集点，村民集中堆放后由村里转运至垃圾处理厂或填埋，在其他地方，更多的是随意丢弃[5]。对农村的土壤、河流、空气造成了污染。尤其是其中的有机质部分，极易腐烂变质，易携带滋生病菌的Colibacillus、Salmonella等，对人们的健康造成了很大的威胁[6]。对这部分垃圾需要进行妥善处理。

厌氧消化是一种处理有机废弃物行之有效的方法。它可以生产出清洁能源—沼气，并且沼渣沼液是一种肥料，可以还田利用,实现了该类垃圾的减量化与资源化[7]。也有研究证明，厌氧消化同时可以去除一些病原菌，减少垃圾随意丢弃所带来的病菌感染[8-9]。目前，针对农村有机生活垃圾中致病菌及厌氧发酵的研究较少，本研究利用农村有机生活垃圾开展连续厌氧发酵实验，研究厌氧发酵过程中细菌菌群的变化。沼渣沼液中病原菌携带情况会影响其还田利用，因此本研究有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

根据前期对农村有机生活垃圾成分的调研结果(农村有机生活垃圾中菜叶比例50%，果皮25%，剩饭20%，废旧纸张5%)收集研究所附近菜市场以及餐馆的有机垃圾按比例配置成农村有机生活垃圾。收集到的垃圾挑选出塑料袋、筷子、等不可发酵物质，分别做切碎处理(粒径1 cm)和粉碎处理(粒径1 mm)。接种物取自农业部沼气科学研究所实验基地。原料及接种物性质见表1。

表1 农村有机生活垃圾及接种物性质 (%)

1.2 实验装置及方法

实验装置如图1所示，为CSTR反应器。罐体容积为22 L，有效容积为20 L。设有自动温控及搅拌系统。进料口位于反应器下部，出料口位于反应器上部，中部设有取样口。进料方式为一日一进。采用连续厌氧发酵，原料TS浓度控制在8%，原料发酵罐内原料与接种物按照TS比为1∶1投入，待发酵罐内产气稳定后开始进料，逐步提高进料负荷，直至水力停留时间(HRT)缩短至12天。本次实验选取HRT=15 d，20 d两个阶段进行细菌菌群分析。每次进料前将原料TS浓度用沼液控制到8%。微量元素添加量如下：Fe 4 g·L-1, Co 0.58 ug·L-1, Ni 2 mmol·L-1。实验条件设置如表2所示。

图1 实验装置示意图

粒径为1 cm和1 mm，温度为35℃，搅拌条件为转速为60 r·min-1，每10 min搅拌一次。采用LML-1型湿式气体流量计记录沼气产量，使用气袋收集沼气以用来测量沼气成分。

表2 实验条件设置

每天记录甲烷产量，每天取样测pH值和挥发酸。

1.3 分析方法

日产气量由流量计读数所得。

气体成分由便携式气体成分分析仪测量所得。仪器型号为：BIOGAS-5000。

pH值测定，便携式pH计型号为pH-100。

细菌菌群变化由上海美吉生物科技有限公司进行测序分析，测序方法采用16s-rDNA分析技术。

2 结果与讨论

2.1 日沼气产量与水力停留时间的关系

如图2所示，为两个反应器在HRT为20 d和15 d 阶段的日产沼气量，每个阶段为期10 d。日产沼气量随水利停留时间缩短而提高。水利停留时间为20 d时，1#反应器中的日产沼气量高于2#反应器中的日产沼气量，表明在该水利停留时间条件下，反应温度为35℃时，原料粒径为1 cm时的日产沼气量高于原料粒径为1 mm。水利停留时间为15 d时，2#反应器中的日产沼气量高于1#反应器中的日产沼气量，表明在该水利停留时间条件下，反应温度为35℃时，原料粒径为1 mm时的日产沼气量高于原料粒径为1 cm。1#反应器中的容积产气率由1.8 L·L-1d-1提高到2.69 L·L-1d-1，2#反应器中的容积产气率由2.14 L·L-1d-1提高到2.96 L·L-1d-1，表明原料粒径越小，水利停留时间缩短对沼气产量的提升程度越大。

图2 日产沼气

2.2 甲烷含量变化

如图3所示为甲烷含量变化，可以看到，1#反应器中沼气的甲烷含量要高于2#反应器中沼气甲烷含量。表明，原料粒径小，发酵体系中原料水解酸化速率高，体系中挥发酸浓度较高，抑制了产甲烷菌的活性，使得沼气中甲烷含量低[10]。两个反应器沼气中甲烷含量均在50%以上。

图3 甲烷含量变化

2.3 pH值变化

图4所示为两个反应器中pH值的变化。水利停留时间为20 d时，pH值均偏高，当水利停留时间为15 d时，pH值下降，表明随着水利停留时间缩短，发酵体系中挥发酸积累量提高，使得pH值下降。两个反应器中的pH值均处于发酵正常范围内。

图4 pH值变化

2.4 细菌菌群变化

图5～图6为原料和沼渣中细菌菌群结构图。图5为原料细菌菌群结构图，在4个批次的原料中，存在的病原菌为Enterobacter和Enterococcus。其中，Enterobacter所占比例分别为为21%，6%，13.1%，11.4%。Enterococcus在第3批次的原料中所占比例为2.91%，在其他批次的原料中比例很小。其余优势菌主要有Lactobacillus，Leuconostoc，Weissella，Acetobacter，Streptococcus等。未检测到Salmonella、ShigellaCastellani及StaphylococcusAureus。图6为两个反应器中7个不同时间段沼渣中细菌群落结构图，其主要细菌菌群为Rikenella，Rumin，Lachnospira，clostridium等，未检测到Enterobacter，Enterococcus，Salmonella，ShigellaCastellani及StaphylococcusAureus。

图5 原料中细菌菌群变化

图6 沼渣中细菌菌群变化

Enterobacter是一种不治病或条件致病菌，在机体免疫能力低下时，容易发生感染。Enterococcus是一种革兰氏阳性菌，其致病能力强。因此，对这两种菌的去除显得很重要。通过本次实验发现，厌氧作用对这两种菌具有100%的去除能力，消除了这两种菌伴随有机生活垃圾而对人、畜的健康威胁。Leena[11]等人通过研究发现厌氧消化可以去除猪粪中Salmonella和Colibacillus等病原菌。原料中大量存在着Weissella，它是一种以葡萄糖为底物产生乳酸的细菌，能够参与食品的腐烂变质。张严化发现，在餐厨废弃物早期储运过程中，Weissella，Lactobacillus，Streptococcus为主要优势菌，在米面型餐厨废弃物和肉菜型餐厨废弃物中有差别[12]。Salmonella，ShigellaCastellani及StaphylococcusAureus是人畜共患菌，在食品和饲料中污染比较严重，在本4批原料中未测得这些菌，表明在实验室条件下对农村有机生活垃圾进行收集，虽然是在一个开放的、非严格控菌的条件下，农村有机生活垃圾不会被Salmonella，ShigellaCastellani及StaphylococcusAureus感染。张严化[12]在研究餐厨废弃物早期储运过程中细菌菌群变化中同样也未发现这些菌。

对沼渣中细菌菌群进行群落结构分析发现，主要以发酵性细菌为主，Rikenella，Rumin，Lachnospira，Clostridium等均属于Bacteroidetes和Firmicutes[13]，这些细菌可以分一系列解大分子物质如蛋白质、碳水化合物等，将这些有机物转变为乙酸、丙酸、丁酸等挥发性有机酸[14]。这与前人所得结果类似[15-17]。

通过细菌菌群结构分析发现，原料中主要以Lactobacillus和Weissella等为主，这些菌为兼性厌氧细菌，他们主要以原料中有机物为底物，分解产生乳酸；原料进入发酵罐后，发酵体系为严格厌氧环境，原料本身携带的细菌不适应发酵罐中环境，发酵体系中发酵性细菌逐渐取代原料中原有细菌，直至完全取代。随着沼气发酵过程的进行，原料中原有的细菌菌群已经发生的变化。

3 结论

(1)农村有机生活垃圾在TS为8%的时候进行连续厌氧发酵，原料粒径为1 mm时，发酵效果优于原料粒径为1 cm。HRT=20 d时，最佳容积产气率为2.14 L·L-1d-1，HRT=15 d时，最佳容积产气率为2.96 L·L-1d-1。

(2)厌氧发酵对农村有机有机生活垃圾中的Enterobacter和Enterococcus有良好的灭杀效果，证明厌氧发酵可以去除农村有机生活垃圾中此类病原菌对环境的影响。

(3)随着沼气发酵的进行，原料中原有的细菌菌群发生变化，由原先的Lactobacillus及Weissella转变为发酵性细菌。