端锚聚合酶抑制剂XAV939抑制人骨肉瘤SOSP—9607细胞增殖及作用机制研究

董永红 彭雯 王耀华 张丽艳

摘 要 目的：研究端錨聚合酶抑制剂XAV939对人骨肉瘤SOSP-9607细胞增殖的抑制及其作用机制。方法：以人骨肉瘤SOSP-9607细胞为研究对象，采用CCK-8法测定0.5、1、5、10 μmol/L XAV939分别作用24、48、72 h后的细胞增殖情况，并计算细胞抑制率；采用流式细胞术检测5 μmol/L XAV939作用72 h后的细胞凋亡情况及周期分布；以甘油醛-3-硫酸脱氢酶（GAPDH）为内参，采用蛋白质印迹法测定0.5、1、5、10 μmol/L XAV939作用72 h后细胞中β-联蛋白（β-catenin）、G1/S期特异性周期蛋白D1（Cyclin D1）和基质金属蛋白酶7（MMP-7）的相对表达量。结果：1 μmol/L XAV939作用72 h后，5、10 μmol/L XAV939作用24、48、72 h后，SOSP-9607细胞的抑制率均显著升高（P<0.05或P<0.01）。5 μmol/L XAV939作用72 h后，SOSP-9607细胞的凋亡率从3.71%上升至21.03%（P<0.05）；G1期细胞的比例由45.5%增至54.8%，S期细胞的比例由27.4%降至24.0%，G2/M期细胞的比例由22.2%降至16.2%（P<0.05）。5、10 μmol/L XAV939作用72 h后，SOSP-9607细胞中β-catenin、Cyclin D1和MMP-7的相对表达量均显著下降（P<0.05或P<0.01）。结论：端锚聚合酶抑制剂XAV939能够抑制人骨肉瘤SOSP-9607细胞的增殖，其机制可能与其将细胞周期阻滞于G1期、阻断细胞外因子（Wnt）/β-catenin信号通路有关。

关键词 人骨肉瘤SOSP-9607细胞；端锚聚合酶抑制剂；XAV939；细胞外因子/β-联蛋白信号通路；增殖；凋亡

中图分类号 R966；R738 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）14-1917-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.11

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the inhibitory effect of tankyrase inhibitor XAV939 on human osteosarcoma SOSP-9607 cells and its mechanism. METHODS： The human osteosarcoma SOSP-9607 cells were selected as research objects. The proliferation of osteosarcoma cells was determined by CCK-8 method after treated with 0.5， 1， 5， 10 μmol/L XAV939 for 24， 48， 72 h， and the inhibitory rate was calculated. After treated with 5 μmol/L XAV939 for 72 h， flow cytometry was applied to detect cell apoptosis and cell cycle distribution of osteosarcoma cells. Using glyceraldehyde-3-dehydrogenase （GAPDH） as internal reference， Western blot assay was used to detect the relative expression of β-catenin， Cyclin D1 and MMP-7 in osteosarcoma cells after treated with 0.5， 1， 5， 10 μmol/L XAV939 for 72 h. RESULTS： After treated with 1 μmol/L XAV939 for 72 h， 5， 10 μmol/L XAV939 for 24， 48， 72 h， the inhibitory rates of SOSP-9607 cells were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After treated with 5 μmol/L XAV939 for 72 h， the apoptotic rate of SOSP-9607 cells was increased from 3.71% to 21.03% （P<0.05）； the proportion of G1-phase cells increased from 45.5% to 54.8%， that of S-phase cells decreased from 27.4% to 24.0%， that of G2/M-phase cells decreased from 22.2% to 16.2% （P<0.05）. After treated with 5， 10 μmol/L XAV939 for 72 h， the relative expression of β-catenin， Cyclin D1 and MMP-7 in SOSP-9607 cells decreased significantly（P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Tankyrase inhibitor XAV939 can inhibit the proliferation of human osteosarcoma SOSP-9607 cells， the mechanism of which may be associated with arresting cells at G1 phase and blocking signaling pathway of Wnt/β-catenin.

KEYWORDS Human osteosarcoma SOSP-9607 cells； Tankyrase inhibitor； XAV939； Wnt/β-catenin signaling pathway； Proliferation； Apoptosis

骨肉瘤是起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨肿瘤，好发于青少年，且多发病于胫骨近端、股骨远端和长骨干骺端[1]。骨肉瘤的血行转移发生早且发生率很高，患者病情进展迅速，病死率较高[2]。虽然接受手术联合化疗的骨肉瘤患者5年生存率可达50%～70%[3]，但近30年来，由于患者对传统铂类化疗药物的耐受，其5年生存率并无明显提升，且发生转移的患者5年生存率仅为20%～30%[4]。因此，寻找具有新靶点的骨肉瘤靶向治疗药物是目前国内外研究的主要方向和热点。

端锚聚合酶是一种多功能蛋白质翻译修饰酶，是多腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]家族的一员，其主要结构域为锚蛋白重复序列。该酶不仅可与端粒重复序列因子结合，还能与轴抑制蛋白羧基端的高度保守结构域结合，实现了对端粒酶的抑制作用，以进一步调节细胞外因子（Wnt）/β-联蛋白（β-catenin）信号通路[5]。XAV939是2009年《自然》（Nature）杂志报道的一种端锚聚合酶抑制剂，其分子式为C14H11F3N2OS，分子量为312.31，是基于端锚聚合酶1/2的晶体结构直接合成的，其可通过稳定轴抑制蛋白的表达选择性阻滞Wnt/β-catenin信号通路的活化，从而限制肿瘤细胞的增殖与生长[6]。有研究者证实，XAV939能够抑制Hela、MCF-7等乳腺癌细胞系的Wnt/β-catenin信号通路，显著抑制其增殖[7]；此外，XAV939对结直肠癌[8]、肝癌[9]的抑制作用已经相关临床前研究证实。但其对骨肉瘤的治疗作用尚鲜见相关文献报道。为此，本研究拟探究XAV939对人骨肉瘤SOSP-9607细胞增殖的抑制作用，并初步探讨其分子机制，以期为骨肉瘤的靶向治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

371型CO2细胞培养箱（美国Thermo Electron公司）；CytoFLEX型流式细胞仪（美国Beckman公司）；Model 680型酶标仪、Gel Doc EZ型全自动凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；DFC-259型倒置显微镜（德国Leica公司）；FA2004A型电子分析天平（上海精天电子仪器有限公司）；SK-30型高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；KH-300GDV型超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

端锚聚合酶抑制剂XAV939（批号：044M4713V，纯度：>99%）、十二烷基磺酸钠（批号：09/2016）、考马斯亮蓝G-250（批号：07/2016）、蛋白裂解液（批号：01/2017）、硝酸纤维素膜（批号：11/2016）均购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基（批号：20160924）、胎牛血清（批号：201702124）、L-谷氨酰胺（批号：20161109）、青霉素及链霉素（批号：20170117）、磷酸盐缓冲液[PBS，pH=7.4（下同），批号：20170105]、胰蛋白酶（批号：20170209）均购自北京索莱宝生物科技有限公司；CCK-8检测试剂盒（上海碧云天生物技术研究所，批号：P0018）；膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒（含Annexin Ⅴ-FITC染料、PI染料、PBS，北京雷根生物技术有限公司，批号：DG0043）；Hoechst 33342/PI细胞凋亡检测试剂盒（含Hoechst 33342染料、PI染料、PBS，北京旷博生物技术有限公司，批号：RR013A）；蛋白质印迹法（Western blot）封闭缓冲液（pH=7.4，批号：HE209354）、羊抗兔二抗（批号：QE218426）均购自美国Thermo公司；甘油醛-3-硫酸脫氢酶（GAPDH）一抗（批号：SC-5364）、G1/S期特异性周期蛋白D1（Cyclin D1，批号：SC-5289）一抗、基质金属蛋白酶-7（MMP-7，批号：SC-785）一抗及β-catenin（批号：SC-6586）一抗均购自美国Santa Cruz公司；其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 细胞

人骨肉瘤SOSP-9607细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。

2 方法

2.1 溶液制备

用二甲基亚砜（DMSO）溶解XAV939，制成XAV939浓度为10 mmol/L的贮备液，超声（功率：200 W，频率：25 kHz）10 min后，经0.22 μm微孔滤膜滤过，滤液于4 ℃避光保存，备用。临用前用培养基稀释至相应浓度。

2.2 细胞培养

将人骨肉瘤SOSP-9607细胞株置于含10%热灭活胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、25 μg/mL链霉素和50 U/mL青霉素的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、5%CO2、100%饱和湿度的细胞培养箱中进行培养。待细胞生长至培养容器底面积的70%以上时，用PBS清洗，以胰蛋白酶消化传代。每隔2～3 d换液1次。每天均使用倒置显微镜观察，记录细胞数量和状态等指标。

2.3 细胞增殖检测

取对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，按每孔5.0×103个细胞接种于96孔板中，于37 ℃、5%CO2条件下孵育24 h。分别设立空白对照组和给药组，空白对照组加入等体积的培养基，给药组分别加入不同浓度（0.5、1、5、10 μmol/L）的XAV939（浓度选择参考文献[7-8]），每组设置3个复孔（下同）。更换培养基后，于37 ℃、5%CO2条件下再分别培养24、48、72 h。终止培养后，每孔加入CCK-8试剂20 μL，于37 ℃条件下避光反应4 h。使用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的光密度（OD）值，计算细胞抑制率[细胞抑制率（%）=（1-给药组平均OD值）/空白对照组平均OD值×100%]，空白对照组的细胞抑制率为0[10]。

2.4 细胞凋亡检测

取对数生长期细胞，按每孔5.0×105个细胞接种于6孔板中，于37 ℃、5%CO2条件下孵育24 h。分别设立空白对照组和给药组，空白对照组加入等体积的培养基，给药组加入5 μmol/L的XAV939（综合考虑试验成本及前期毒性试验结果），更换培养基后，于37 ℃、5%CO2条件下再培养72 h。使用Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况：收集并调整细胞悬液至约1×106 mL-1，以转速800 r/min离心3 min，沉淀用PBS清洗2次后，重悬于PBS 200 μL中；加入Annexin Ⅴ-FITC染料10 μL，轻轻混匀，于室温下避光反应15 min，再加入PI染料10 μL，于4 ℃下避光反应5 min。使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果采用Cell Quest 3.0软件分析。

2.5 细胞周期分析

取对数生长期细胞，按每孔5.0×105个细胞接种于6孔板中，于37 ℃、5%CO2条件下孵育24 h。分别设立空白对照组和给药组，空白对照组加入等体积的培养基，给药组加入5 μmol/L的XAV939（综合考虑试验成本及前期毒性试验结果），更换培养基后，于37 ℃、5%CO2条件下再培养72 h。使用Hoechst 33342/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞周期：收集细胞并调整细胞悬液至约1×106 mL-1，以转速800 r/min离心3 min，沉淀用PBS清洗2次后，重悬于PBS 200 μL中；加入Hoechst 33342染料10 μL，轻轻混匀，于室温下避光反应15 min，再加入PI染料10 μL，于4 ℃下避光反应5 min。使用流式细胞仪检测细胞周期，结果采用Cell Quest 3.0软件分析。

2.6 蛋白表达检测

采用Western blot法检测。取对数生长期细胞，按每孔5.0×105个细胞接种于6孔板中，于37 ℃、5%CO2条件下孵育24 h。分别设立空白对照组和给药组，空白对照组加入等体积的培养基，给药组分别加入不同浓度（0.5、1、5、10 μmol/L）的XAV939，更换培养基后，于37 ℃、5%CO2条件下再培养72 h。培养结束后收集细胞，加入预冷的蛋白裂解液100 ?L重悬细胞，冰上孵育60 min，裂解细胞，裂解液以转速12 000 r/min离心10 min后，收集上清液。上清液于100 ℃金属浴中静置5 min以变性蛋白。取蛋白20 μg进行10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳分离，并转移至硝酸纤维素膜上，于室温下在封闭缓冲液中孵育30 min，加入GAPDH一抗（1 ∶ 500）、Cyclin D1一抗（1 ∶ 300）、MMP-7一抗（1 ∶ 500）、β-catenin一抗（1 ∶ 300），室温下孵育60 min。洗膜后，加入羊抗兔二抗（1 ∶ 300），室溫下孵育60 min，采用化学发光法以考马斯亮蓝G-250标记，于凝胶成像系统上分析。以GAPDH为内参，用目标蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值来表示目标蛋白的相对表达量，空白对照组各蛋白的相对表达量均为1[11]。

2.7 统计学方法

采用SPSS 15.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 XAV939对人骨肉瘤SOSP-9607细胞增殖的影响

与空白对照组比较，1 μmol/L XAV939作用72 h后，5、10 μmol/L XAV939作用24、48、72 h后，SOSP-9607细胞的抑制率均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），详见表1。

3.2 XAV939对人骨肉瘤SOSP-9607细胞凋亡的影响

经5 μmol/L XAV939作用72 h后，SOSP-9607细胞的凋亡率从3.71%上升至21.03%，差异有统计学意义（P<0.05），详见图1。

3.3 XAV939对人骨肉瘤SOSP-9607细胞周期分布的影响

经5 μmol/L XAV939作用72 h后，G1期细胞的比例由45.5%增至54.8%，S期细胞的比例由27.4%降至24.0%，G2/M期细胞的比例由22.2%降至16.2%，差异均有统计学意义（P<0.05），详见图2。

3.4 XAV939对人骨肉瘤SOSP-9607细胞中β-catenin、Cyclin D1、MMP-7表达的影响

与空白对照组比较，5、10 μmol/L XAV939作用72 h后，SOSP-9607细胞中β-catenin、Cyclin D1、MMP-7的相对表达量均显著下降，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），详见图3、表2。

4 讨论

骨肉瘤在骨肿瘤中的占比高达20%，是最常见的原发性恶性骨肿瘤[12]。临床上骨肉瘤绝大部分为高度恶性，且常发生于青少年的长骨干骺端等部位，且90%以上的骨肉瘤患者会发生肺部转移[13]。Wnt/β-catenin信号通路是一个多环节、多作用位点的生长发育调控信号通路，在动物胚胎发育和肿瘤发生的过程中具有重要作用[14]。近来研究发现，Wnt/β-catenin信号通路是激活骨肉瘤细胞发生转移的重要诱导因子，在高转移性骨肉瘤细胞系中，β-catenin蛋白的表达明显上调[14]。Wnt与β-catenin受体竞争性结合，抑制细胞质中β-catenin的降解，导致胞浆中高浓度的β-catenin通过转位移至细胞核内，调控相关靶基因表达和细胞周期分布，从而发挥抗凋亡等一系列作用[15]。因此，Wnt/β-catenin信号通路可能成为骨肉瘤治疗药物研发的重要靶点。

端錨聚合酶抑制剂XAV939是一个由生物遗传学方法合成的端锚聚合酶小分子抑制剂，是Wnt/β-catenin信号通路的正向调控因子[16]。XAV939可与端锚聚合酶的PARP结构域结合，稳定β-catenin降解复合物中的轴抑制蛋白，选择性抑制β-catenin介导的转录作用，从而减少下游靶基因的激活；另一方面，XAV939还可直接抑制端粒酶活性，限制染色体末端的延伸，从而起到阻止细胞增殖的作用[17]。现有文献已报道了XAV939通过阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制DLD-1[8]、SKOV3[18]、MCF-7[19]等多种肿瘤细胞系的增殖，但鲜见XAV939对骨肉瘤细胞系抑制作用的相关报道。为此，本研究将XAV939作用于人骨肉瘤SOSP-9607细胞，通过CCK-8法测定不同浓度XAV939分别作用24、48、72 h后的细胞增殖情况，结果发现1 μmol/L XAV939作用72 h后，5、10 μmol/L XAV939作用24、48、72 h后均可不同程度地抑制SOSP-9607细胞增殖，且较高浓度的XAV939具有更显著的增殖抑制作用。凋亡抵抗是保证肿瘤细胞存活的关键分子机制。Shin JH等[20]研究发现，XAV939能够使细胞周期阻滞在G1期，阻滞细胞进入S期。本研究通过流式细胞术检测5 μmol/L XAV939作用72 h后的细胞凋亡情况和周期分布，发现XAV939显著提高了SOSP-9607细胞的凋亡率，并将细胞周期阻滞在G1期，导致S期和G2/M期细胞的比例下降。这提示XAV939能够诱导骨肉瘤细胞凋亡，并可干扰细胞的周期分布。

Wisman GB等[21]研究发现，抑制Wnt/β-catenin信号通路后，骨肉瘤细胞核中的β-catenin水平下调，进而抑制MMP-7、Cyclin D1等下游靶基因的表达，其一方面下调了c-myc和Survivin等基因的表达以及Cyclin D1蛋白的水平，并通过调节细胞周期来抑制细胞增殖、促进细胞凋亡或坏死；另一方面通过下调MMP-7蛋白的表达，抑制了细胞外基质的降解，从而抑制骨肉瘤细胞的转移。动物实验研究也证实，在骨肉瘤小鼠模型中，通过注射Wnt拮抗药抑制Wnt/β-catenin信号通路，可明显抑制小鼠体内骨肉瘤移植瘤细胞的生长和转移[22]。本研究采用Western blot法检测不同浓度XAV939对人骨肉瘤SOSP-9607细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响，结果发现5、10 μmol/L XAV939能显著抑制SOSP-9607细胞β-catenin、Cyclin D1、MMP-7蛋白的表达。这提示XAV939可能通过阻滞Wnt/β-catenin信号通路来抑制SOSP-9607细胞的增殖，并促进其凋亡，与文献报道的XAV939对结直肠癌细胞[8]和肝癌细胞[9]的抑制作用及其机制基本相同。

综上所述，XAV939能够抑制人骨肉瘤SOSP-9607细胞的增殖，并促进细胞凋亡，其机制可能与其将细胞周期阻滞于G1期、阻断Wnt/β-catenin信号通路有关。尽管XAV939在体外显示出对骨肉瘤细胞较强的抑制作用，但其具体机制及在人体内的作用仍有待后续研究深入探讨。

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（收稿日期：2018-01-04 修回日期：2018-05-09）

（編辑：张元媛）