Box—Behnken响应面法优化荜茇总生物碱的提取工艺研究

杨家强 车万莉 彭红艳 王维

中图分类号 R283 文献标志码 A 文章編号 1001-0408（2018）13-1802-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.18

摘 要 目的：优化荜茇总生物碱的提取工艺，为荜茇的深入开发和综合利用提供参考。方法：以总生物碱（指标性成分为胡椒碱）的提取率为考察指标，药材粉碎度、液料比、提取时间、提取次数为考察因素，采用单因素试验和Box-Behnken响应面法优化荜茇总生物碱的提取工艺，并进行3次（荜茇用量分别为1.00、10.00、100.00 g）验证试验。结果：最优提取工艺为粉碎度90目，加入32倍量的无水乙醇提取3次，每次提取170 min。最优工艺条件下，在荜茇用量为1.00、10.00、100.00 g时荜茇总生物碱的提取率分别为5.015、5.028、5.041 mg/g，与预测值5.025 mg/g的相对误差分别为0.20%、0.06%、0.26%，差异较小。结论：本研究优选的荜茇总生物碱的提取工艺合理、稳定、可行。

关键词 荜茇；总生物碱；Box-Behnken响应面法；提取率；提取工艺

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of total alkaloids from Piper longum， and to provide reference for deep development and comprehensive utilization of P. longum. METHODS： With the extraction rates of total alkaloids （the target component for piperine） as reference index， using comminution degree of medicinal materials， liquid-solid ratio， extraction time and extraction times as factors， single factor test and Box-Behnken response surface methodology were adopted to optimize the extraction technology of total alkaloids from P. longum. The validation tests were conducted for 3 times （the amounts of P. longum were 1.00， 10.00， 100.00 g）. RESULTS： The optimal extraction technology was that comminution degree of 90 mesh， 32-fold absolute ethanol， extracting for 3 times， lasting for 170 min each time. Under optimal technology， the extraction rates of total alkaloids from P. longum were 5.015， 5.028， 5.041 mg/g when the amount of P. longum were 1.00， 10.00， 100.00 g； relative errors of them to predicted value 5.025 mg/g were 0.20%， 0.06%， 0.26%， respectively. There was small difference. CONCLUSIONS： The optimal extraction technology of total alkaloids of P. longum is reasonable， stable and feasible.

KEYWORDS Piper longum； Total alkaloids； Box-Behnken response surface methodology； Extraction rate； Extraction technology

荜茇为胡椒科植物荜茇（Piper longum L.）的干燥近成熟或成熟果穗，味辛、热，具有温中散寒、下气止痛之功效，用于脘腹冷痛、呕吐、寒凝气滞、胸痹心痛、头痛、牙痛等[1]。现代研究表明，荜茇具有抗氧化、抗血小板集聚、抗高血脂和抗菌等多种作用[2-4]。荜茇中生物碱种类较多、含量高，具有多种生物活性，在医药和农业中的应用均较广泛[5]。研究显示，荜茇总生物碱对多种实体肿瘤和血液病均有抑制作用，具有很好的清除自由基能力[6]；对6-羟基多巴胺诱导的帕金森病模型大鼠的黑质细胞具有保护作用[7]；此外，还具有杀虫、杀螨作用[8]等。Box-Behnken响应面法是一种优化工艺条件的有效方法，已被广泛地用于多因素的试验优化[9-10]。本研究拟采用Box-Behnken响应面法优化荜茇总生物碱的提取工艺，为荜茇的质量控制以及对其深入开发和综合利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

BS224S电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；510酸度计（北京中西远大科技有限公司）；XS-04B多功能粉碎机（东莞市隆鑫机电设备有限公司）；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 药材、对照品与试剂

荜茇药材（遵义中药材公司，批号：160056，由遵义医学院杨建文主任药师鉴定为真品）；胡椒碱对照品（上海雅吉生物科技有限公司，批号：16041311，纯度：99.99%）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 荜茇總生物碱的提取

取荜茇药材切成小段，粉碎机粉碎，过筛，取一定量的粉末，置于圆底烧瓶中，再加入无水乙醇，加热回流提取，过滤，合并滤液，浓缩，收集备用。

2.2 荜茇总生物碱的含量测定

采用酸性染料比色法[11]测定荜茇总生物碱的含量。精密称取0.010 0 g胡椒碱对照品，置于25 mL棕色量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。取适量上述溶液，再用无水乙醇分别稀释制成质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/L的对照品溶液。精密量取0.5 mL上述各对照品溶液，置于6个分液漏斗中，分别加入6.0 mL溴百里香酚蓝溶液和pH 6.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液4.0 mL，摇匀；加入20 mL二氯甲烷，振摇，静置30 min。然后在418 nm波长处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标（y）、质量浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，得到标准曲线的方程为y=49.694x-0.021 3（r2=0.999 2），结果表明，胡椒碱质量浓度在0.053～20.65 mg/L范围内线性关系良好。根据标准曲线计算荜茇总生物碱的提取率：总生物碱提取率=CV1V2/V3W×100%（C=测量液总生物碱的浓度；V1=测量液定容的体积；V2=提取液定容的体积；V3=测量时量取的体积；W=样品的质量）。

2.3 单因素试验考察

在对中药材生物碱提取的过程中，药材粉碎度、溶剂种类、提取的料液比、提取时间以及提取次数等因素对提取率有着重要影响[12-13]。因此，在本工艺优化试验中，笔者选择如下因素进行考察。

2.3.1 药材粉碎度 取荜茇粉末，过20、40、60、80、100目标准筛，分别精密称取不同粉碎度样品1.00 g，置于圆底烧瓶中，在室温下用10倍量体积的无水乙醇浸提2 h，计算出不同粉碎度样品中总生物碱的提取率。结果显示，过20、40、60、80、100目标准筛样品中荜茇总生物碱的提取率分别为2.92、3.12、3.21、3.30、3.22 mg/g，故确定80目荜茇细粉为最优提取粉碎度。

2.3.2 液料比 精密称取6份荜茇细粉（过80目标准筛），每份1.00 g，分别置于圆底烧瓶中，依次加入10、20、30、40、50、60倍量的无水乙醇，浸润30 min后，加热回流提取2 h，计算不同液料比下样品总生物碱的提取率。结果显示，加入10、20、30、40、50、60倍量的无水乙醇提取后荜茇总生物碱的提取率分别为3.30、3.41、3.59、3.43、3.42、3.31 mg/g，故确定液料比30 ∶ 1为最优提取条件。

2.3.3 提取时间 精密称取6份荜茇细粉（过80目标准筛），每份1.00 g，分别置于圆底烧瓶中，加入30倍量的无水乙醇，浸润30 min后，分别加热回流提取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，计算不同提取时间下样品总生物碱的提取率。结果显示，加热回流0.5、1、2、3、4、5 h后荜茇总生物碱的提取率分别为3.05、3.26、3.59、3.75、3.66、3.58 mg/g，故确定加热回流提取3 h为最优提取时间。

2.3.4 提取次数 精密称取4份的荜茇细粉（过80目标准筛），每份1.00 g，分别置于圆底烧瓶中，加入30倍量的无水乙醇，浸润30 min后，分别回流提取1、2、3、4次，每次提取时间为3 h，计算出不同提取次数下样品总生物碱的提取率。结果显示，提取1、2、3、4次后荜茇总生物碱的提取率分别为3.75、4.16、4.93、4.96 mg/g，故确定最优提取次数为3次。

2.4 响应面试验优化

2.4.1 Box-Behnken试验设计 在单因素试验的基础上，选择粉碎度（X1）、液料比（X2）、提取时间（X3）、提取次数（X4）作为考察因素，采用四因素三水平的响应曲面法进行试验。因素与水平见表1，Box-Behnken试验设计与结果见表2。

2.4.2 模型建立与方差分析 通过Design Expert 8.06软件对上述试验结果进行多元回归拟合，得到回归方程：总生物碱提取率（Y）=5.01+0.22X1-0.26X2-0.28X3-0.15X4-0.18X12-0.43X22-0.31X32-0.23X42+0.29X1X2+0.17X1X3-0.15X1X4+0.17X2X3+0.19X2X4+0.27X3X4（R2=0.991 3）。方差分析结果见表3。

由表3可知，荜茇总生物碱提取模型的P<0.05，表明该回归模型是显著的，用该模型对荜茇总生物碱的提取工艺进行分析试验是合理的。根据表3中F值的大小，推测影响本试验提取率大小的因素为X1>X2>X3>X4。从表3中还可以看出，二次项X22、X32、X42对响应值的影响显著（P<0.05）。

2.4.3 响应面分析 用Design Expert 8.06软件分析，得出影响荜茇总生物碱提取率的各因素交互作用的响应面图，结果见图1。

由图1可知，随着液料比的增大，荜茇总生物碱的提取率先呈缓慢上升趋势，达到最大值后开始下降；随着提取时间的增加，能增大荜茇总生物碱的提取率，但是时间过长其提取率有所下降；随着提取次数的增加，提取率有先上升后下降的趋势；从图中也可知，粉碎度的改变对提取率的影响较大，随着粉碎度的增加，提取率逐渐增大，当达到一定程度时，提取率上升缓慢；同时，随着液料比的增大，荜茇总生物碱的提取率也呈现先缓慢上升然后降低的趋势，两者交互影响较显著。

根据上述所得结果，由Design Expert 8.06软件分析得出：在稳定状态下荜茇提取量的最大值为5.021 mg/g，相对应的粉碎度90.26目、液料比32.16 ∶ 1、提取时间2.86 h，提取次数2.91次。以实际操作的方便考虑，将其修正为粉碎度90目，液料比32 ∶ 1，提取时间170 min，提取次数3次。

2.4.4 验证试验 根据优化提取工艺，分别取荜茇样品1.00、10.00和100.00 g进行3次平行试验，结果荜茇总生物碱的平均提取率分别为5.015、5.028和5.041 mg/g（RSD分别为1.5%、2.2%、2.7%，n=3），与预测值5.025 mg/g的相对误差分别为0.20%、0.06%、0.26%。3次平行试验的提取率差异较小，说明该工艺稳定可靠。

3 讨论

中药荜茇的化学成分中含有大量的生物碱，而胡椒碱作为其中主要存在的生物碱[14]，含量高、结构明确、性质稳定、有明显的紫外吸收，故本研究以胡椒碱作为指标性成分考察荜茇总生物碱的提取工艺，具有可行性和科学性。

为了优化荜茇总生物碱的提取工艺，笔者通过预试验先后考察了提取溶剂的种类、药材粉碎度、提取时间、提取次数、提取温度、溶剂的浓度、液料比等对总生物碱提取率的影响。在溶剂方面，笔者首先分别选择了无水乙醇、无水乙酸乙酯和水为溶剂，结果以无水乙醇为溶剂提取效果最好；接着，笔者又分别考察了无水乙醇、90%乙醇和80%乙醇的提取效果，结果随着乙醇体积分数的降低，荜茇总生物碱提取率明显减小，故在本研究中选用无水乙醇为提取溶剂。在提取温度方面，预试验中笔者分别设置提取温度为50、60、70、80 ℃，结果发现，当温度为50、60 ℃时，总生物碱的提取率很低，而将温度从70 ℃升高至80 ℃时，总生物碱的提取率变化不大，故在本研究中未将提取温度作为考察因素。而同时进行的预试验结果显示，药材粉碎度、提取时间、液料比、提取次数的改变对荜茇总生物碱提取率的影响较大。因此，在本研究中笔者选取上述4个因素对荜茇总生物碱的提取工艺进行优化。

本研究结果显示，将荜拨粉碎太细时总生物碱的提取率会下降，这可能是因为过细的粉末使得其吸附作用增强，导致扩散速度而降低，最后影响其浸出效果；也可能是因为粉碎太细使得药材的细胞破裂，致使大量不溶物增加。而较粗的粉末也会导致提取率较低，这可能是与溶剂的接触面小，影响扩散速度和浸出效果有关。荜茇的化学成分中包含的胡椒碱、荜茇明宁碱等生物碱的化学性质比较稳定，故较长的提取时间能获得较高的提取率。合适的料液比能有效除去中药荜茇中的脂质、鞣质等杂质，有助于提高总生物碱的提取率。随着提取次数的增加，在一定次数范围内能提高其提取率，但是随着提取次数的继续增加，溶液中残留的生物碱含量降低，由于提取时间的延长，可能破坏酰胺类生物碱等化学成分的结构，最终导致提取率降低。

综上所述，笔者采用Box-Behnken响应面法优化了荜茇中总生物碱提取工艺，且优化后的提取工艺合理可行。

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（收稿日期：2018-01-19 修回日期：2018-04-10）

（编辑：林 静）