白鲜中梣酮标准样品的制备

王岱杰 宋祥云 耿岩玲 付瑞明 于金倩 王晓

中图分类号 R284 文献标志碼 A 文章编号 1001-0408（2018）13-1776-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.12

摘 要 目的：制备梣酮标准样品，确保梣酮及相关产品检测的准确性、可比性和可溯源性。方法：以芸香科植物白鲜的干燥根皮为原料，采用硅胶柱色谱分离制备梣酮单体。分别采用高效液相色谱（HPLC）法、薄层色谱（TLC）法和液质联用（LC-MS）技术对梣酮单体纯度进行分析，通过紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共振等波谱技术对梣酮单体的结构进行表征，并参照GB/T 15000.3标准样品的工作导则要求考察其均匀性、稳定性和定值。结果：HPLC、TLC和LC-MS检测结果显示，所制单体纯度较高，在相关图谱中无明显杂质峰或斑点存在；经多种波谱技术鉴定分离单体化合物为梣酮；所制梣酮单体的均匀性良好，10瓶样品间纯度差异无统计学意义（P>0.05）；梣酮单体在0～4 ℃条件下贮藏24个月稳定性良好，稳定性的扩展不确定度为0.16%；8家实验室联合定值试验确定其标准值为99.75%，扩展不确定度为0.34%。结论：成功制备了符合GB/T 15000.3要求的梣酮标准样品，该样品可用于梣酮及相关产品的质量控制和检测方法的评定。

关键词 梣酮；标准样品；均匀性；稳定性；定值；不确定度

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare fraxinellone standard sample，and guarantee accuracy，comparability and traceability of fraxinellone and related products. METHODS： Fraxinellone monomer was obtained by means of silica gel chromatography from dried bark of Dictamnus dasycarpus. HPLC，TLC and LC-MS were used to analyze the purity of fraxinellone monomer. Their structures were confirmed by UV，IR，MS and NMR. Homogeneity，stability and constant value of it were investigated by referring to GB/T 15000.3 standard sample. RESULTS： Results of HPLC，TLC and LC-MS showed that the purity of prepared monomer was high. No significant impurity peak or spot was found in related chromatograms. A variety of spectroscopic techniques were used to identify prepared monomeric compound as fraxinellone. Prepared fraxinellone monomer had good uniformity， there was no statistical significance in purity difference among 10 samples（P>0.05）. The stability of prepared fraxinellone monomer was good at 0-4 ℃ for 24 months， the extended uncertainty of stability was 0.16%. The standard value of fraxinellone monomer was 99.75% in combination constant value tests of 8 laboratories，and expanded uncertainty was 0.34%. CONCLUSIONS： The fraxinellone was successfully prepared that was conformed to the technical requirement of GB/T 15000.3， and it can be used in the content determination and testing method validation of fraxinellone related products.

KEYWORDS Fraxinellone； Standard sample； Homogeneity； Stability； Constant value； Uncertainty

标准样品是具有一种或多种足够均匀的、确定了特性值的材料或物质，可以用来校准仪器、评价测量方法和给材料赋值[1]。随着天然产物（包括中药材）的发展日益国际化，对于符合国际标准化组织（ISO）要求的标准样品的需求进一步迫切，其研制也成为国内外研究的热点。目前，我国研发的天然产物标准样品种类和数量严重不足，影响了相关产品的检测，也制约了相关行业的发展[2]，为改善这一现状，我国天然产物标准样品的研究正在广泛开展。

白鲜为芸香科植物，多生长于林下、林缘或山坡等地，在我国东北、华北、西北和华东等地区广泛分布，是重要的植物资源，其干燥根皮——白鲜皮为常用大宗药材，具有抗炎、抗菌、抗过敏、杀虫、神经保护等作用[3-9]，临床主要用于治疗湿热疮毒、黄水淋漓、湿疹、风疹、疥癣疮癞、风湿热痹、黄疸尿赤等病症[10]，还可用于治疗皮肤性疾病（如湿疹、皮炎和银屑病）[11]。梣酮为2015年版《中国药典》（一部）中白鲜皮的质量控制指标成分，规定其含量不得少于0.050%（按干燥品计）[10]。现代药理研究表明，梣酮还具有抗炎、保肝、抑菌和杀虫等多种功效[12-19]。目前市场上梣酮样品主要以对照品为主，纯度参差不齐，未按照国家标准进行均匀性、稳定性和定值试验，最终结果没有不确定度评价，样品也不具有溯源性。因此，为了满足梣酮及相关产品的检测需求，保证检测结果的准确性、可比性和溯源性，笔者参照GB/T 15000.3标准样品的工作导则[20]，制备了梣酮国家标准样品。

1 材料

1.1 儀器

R-3型旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；SCIENTZ- 10N型冷冻干燥仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；1260型高效液相色谱（HPLC）仪、6520 Q-TOF型液质联用（LC-MS）仪（美国安捷伦公司）；WRS-1B型数字熔点仪（上海精密科学仪器有限公司）；UV-2550型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；INOVA 600 MHz型核磁共振（NMR）波谱仪（美国Varian公司）。

1.2 药材与试剂

白鲜皮药材购自济南建联中药店，经山东中医药大学李佳教授鉴定为芸香科植物白鲜（Dictamnus dasycarpus Turcz.）的干燥根皮，样本存放于山东省分析测试中心，样品编号为2014060203；甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 梣酮单体的制备

取白鲜皮药材500 g，粉碎至40目，95%乙醇加热回流3次，每次3 h，抽滤，减压浓缩至无醇味；将提取物加水分散，用乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩，得到乙酸乙酯浸膏17.3 g，冰箱中保存备用。

将乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯溶剂体系梯度（100 ∶ 1、50 ∶ 1、20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、 3 ∶ 1、2 ∶ 1、1 ∶ 1，V/V）洗脱，分瓶收集，薄层色谱（TLC）和HPLC监测（具体条件见“2.2”项下），收集梣酮含量较高的洗脱组分，减压浓缩。将样品用氯仿溶解，放置于室温进行结晶，得到白色针状晶体，即梣酮单体。

2.2 纯度分析

笔者分别采用HPLC法、TLC法和LC-MS法对“2.1”项下分离得到的样品进行纯度分析。

2.2.1 HPLC法 取“2.1”项下分离的单体样品，以甲醇为溶剂，制备成质量浓度为0.5 mg/mL的样品溶液，分别按以下两种洗脱条件进样测定。（1）等度洗脱。色谱柱：Shim-pack C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（62 ∶ 38，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；运行时间：30 min；检测波长：213 nm；进样量：10 μL。（2）梯度洗脱。色谱柱：YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A相为甲醇，B相为水，梯度洗脱（0～20 min，62%A；20～40 min，62%→100%A；40～50 min，100%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；运行时间：50 min；检测波长：213 nm；进样量：10 μL。采用HPLC的二极管阵列检测器（DAD检测器）对色谱峰进行3D总吸收图扫描，检测结果扣除溶剂峰。HPLC纯度分析结果表明，未见明显杂质峰存在，色谱图见图1。

2.2.2 TLC法 精密称取“2.1”项下样品5 mg，加甲醇制备成质量浓度为0.2 mg/mL的样品溶液。展开剂分别为正己烷-乙酸乙酯（1 ∶ 1，V/V）和氯仿，定量毛细点样管分别吸取20、40、60、80、100 μg样品，梯度将样品点于GF254硅胶板上，用两种展开剂分别展开，取出，晾干。分别用荧光（波长分别为254 nm和365 nm）和显色剂（10%硫酸乙醇为显色剂，105 ℃下烤3 min）显色，至斑点显色清晰。荧光和显色剂显色结果表明，样品呈现深灰色斑点，比移值（Rf）分别为0.74（图A、B）和0.44（图A′ 、B′ ），未见明显杂质斑点存在，薄层色谱图见图2。

2.2.3 LC-MS法 （1）分析条件：色谱柱为Shim-pack C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（62 ∶ 38，V/V）；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；运行时间为30 min。（2）MS条件：电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式下扫描；毛细管电压为4.0 kV；载气为氮气，载气流速为10 L/min，载气温度为300 ℃；扫描范围为质荷比（m/z）100～1 000。根据LC-MS结果可见，图谱中未见明显的杂质峰存在，总离子流图见图3。

2.3 结构表征

采用紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、MS和NMR等技术对梣酮单体的结构进行表征。UV法的测试溶剂为甲醇，扫描范围为200～400 nm；IR法采用溴化钾（KBr）压片，扫描波数为400～4 000 cm-1；MS为ESI源，载气为氮气，载气温度为300 ℃，载气流速为10 L/min，毛细管电压为4.0 kV，扫描范围m/z为100～1 000；NMR 法的氘代试剂为CDCl3。结果，样品的熔点为115～116 ℃；UV[λEtOH][max]：213 nm；[IRcm-1][Vmax]：2 932、2 878（νCH），1 743 （νC=O）、1 672（νC=C），1 453、1 373（δCH），1 204、1 023（νCO）；ESI-MS：m/z [M+H]+为233.110 4，[M+Na]+为255.092 6，[2M+Na]+为487.194 9，[M-H]-为231.094 2。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.48（1H，brs，H-5′ ），7.44（1H，brs，H-2′ ），6.35（1H，brs，H-4′ ），2.13～2.30（2H，m，H-6），2.14（3H，s，8-CH3），1.70-1.87（2H，m，H-5），1.43～1.48（2H，m，H-4），0.86（3H，s，9-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：169.9（C-1），148.6（C-7），143.4（C-5′ ），139.8（C-2′ ），127.4（C-7a），120.6（C-3′ ），108.6（C-4′ ），83.4（C-3），43.0（C-3a），32.1（C-6），31.6（C-5），20.3（C-4），18.5（C-9），18.2（C-8）。以上数据与文献[21]比较基本一致，故确定本研究分离单体为梣酮。

2.4 均匀性检验

将分离制备的梣酮样品进行分装，每瓶10 mg，依据标准样品导则中均匀性检验要求[20]，采用顺序重复随机测量，随机抽取分装好的样品10瓶（>1.5[√N] [3]，N为所分装梣酮的瓶数），按抽样顺序的不同，将试验分为3组（第1组抽样顺序为1-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第2组抽样顺序为10-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第3组抽样顺序为2-4-6-8-10-1-3- 5-7-9）。样品按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，样品纯度读取采用峰面积归一化法，采用DPS 9.5统计学软件对数据进行方差分析和F检验，确定梣酮样品的均匀性。均匀性检验结果见表1，方差分析结果见表2。

以组间自由度υ1=9及组内自由度υ2=20为变量，查询F界值表，可知临界值F0.05（9，20）=2.94，由于F2.5 稳定性检验

将梣酮样品储存在溫度为0～4 ℃的环境中，考察样品在2年内的稳定性。分别在放置0、6、12、18、24个月时取样品，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，采用峰面积归一化法测定样品纯度，每份样品测定5次。采用DPS 9.5统计学软件对数据进行t检验[22]。采用直线模型，观察直线斜率值变化趋势，计算斜率变化的绝对值，对样品稳定性进行预测。稳定性检测结果见表3。

由于斜率变化的绝对值│b1│

[ 9 ] YOON JS，YANG H，KIM SH，et al. Limonoids from Dictamnus dasycarpus protect against glutamate-induced toxicity in primary cultured rat cortical cells[J]. J Mol Neuro Sci，2010，42（1）：9-16.

[10] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S]. 2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：110-111.

[11] KIM H，KIM M，KIM H，et al. Anti-inflammatory activities of Dictamnus dasycarpus Turcz.，root bark on allergic contact dermatitis induced by dinitrofluorobenzene in mice[J]. J Ethnopharmacol，2013，149（2）：471-477.

[12] KIM J，PARK Y，SHIN J，et al. Fraxinellone inhibits lipopolysaccharide-induced inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 expression by negatively regulating nuclear factor-kappa B in RAW 264.7 macrophages cells [J]. Biol Pharm Bull，2009，32（6）：1062-1068.

[13] SUN Y，QIN Y，GONG F，et al. Selective triggering of apoptosis of concanavalin A-activated T cells by fraxinellone for the treatment of T-cell-dependent hepatitis in mice[J]. Biochem Pharmacol，2009，77（11）：1717-1724.

[14] 冉启琼，阮丽萍，朱丹妮，等.改善梣酮的溶解度以提高其口服吸收分数和对小鼠急性肝损伤的保肝作用[J].药学学报，2007，42（6）：675-680.

[15] 冯静，汪冶，莫非，等.白鲜皮乙酸乙酯部位化学成分及其体外抗幽门螺杆菌活性研究[J].山地农业生物学报，2014，33（2）：85-88.

[16] 张化为，周林洪，邓翀，等.白鲜皮不同极性部位的抗氧化活性及对酪氨酸酶活性的影响[J].中国药房，2017，28（31）：4401-4404.

[17] LIU ZL，HO SH，GOH SH. Effect of fraxinellone on growth and digestive physiology of Asian corn borer，Ostrinia furnacalis Guenee[J]. Pestic Biochem Phys，2008，91（2）：122-127.

[18] GUO Y，YAN Y，YANG C，et al. Regioselective synthesis of fraxinellone-based hydrazone derivatives as insecticidal agents[J]. Bioorg Med Chem Lett，2012，22（17）：5384-5387.

[19] GUO Y，QU H，ZHI X，et al. Semisynthesis and insecticidal activity of some fraxinellone derivatives modified in the B ring[J]. J Agric Food Chem，2013，61（49）：11937- 11944.

[20] 國家质量监督检验总局，国家标准化管理委员会. GB/T 15000.3-2008 标准样品工作导则（3）：标准样品定值的一般原则和统计方法[S].北京：中国标准出版社，2008.

[21] YUAN C，WANG X，YANG D. Antimicrobial and pesticidal activity of fraxinellone from Dictamnus dasycarpus [J]. Chem J Internet，2006，8（1）：33-38.

[22] 国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会. GB/T 8170-2008 数值修约与极限数值的表示和判定[S].北京：中国标准出版社，2008.

（收稿日期：2018-01-07 修回日期：2018-04-16）

（编辑：林 静）