土荆芥腐解液对蚕豆幼苗光合特性和保卫细胞活性的影响

翁可佳　沙尔格　沙马五牛　金古伍支　马丹炜

摘要：[目的]探讨土荆芥腐解液对蚕豆幼苗光合特性和保卫细胞活性的影响，为揭示土荆芥的入侵机制提供理论依据。[方法]采用表皮条分析法和盆栽试验，分析土荆芥腐解液作用下蚕豆幼苗株高、地上部鲜重和干重、叶面积、实际光化学效率（ФPsⅡ）和最大光化学效率（F_v/F_m）等指标的变化情况，并检测保卫细胞的活性及细胞核异常率。[结果]土荆芥腐解液处理蚕豆幼苗的叶面积变化不明显，但地上部生物量和株高显著下降（P<0.05，下同），且具有时间和浓度依赖性；土荆芥腐解液处理蚕豆叶片的叶绿素荧光参数F_v/F_M和ФPsⅡ均发生不同程度变化，但与对照（CK）均无显著差异（P>0.05）。在土荆芥腐解液的作用下，蚕豆叶片的保卫细胞活性降低，细胞核出现错位、固缩、拉长或降解等畸变特征；随腐解液浓度的增加，保卫细胞死亡率及细胞核畸变率显著升高。[结论]土荆芥腐解液对蚕豆幼苗的光反应影响不明显，但其较强的细胞毒性能引起叶片气孔保卫细胞发生畸变，活性降低，进而导致幼苗气孔运动受阻，吸收c02的能力下降，光合效率降低而影响幼苗生长发育。

关键词：土荆芥腐解液；蚕豆幼苗；化感作用；细胞毒性；光合特性

中图分类号：S643.6 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0530-06

0引言

[研究意义]土荆芥（Chenopodium ambrosioi—des L.）又名红泽蓝、杀虫芥、鹅脚草等，为藜科藜属一年或多年生芳香性草本植物（Monzote et a1.，2014），广泛分布于我国20多个省（区），是当地生态系统中的单优种群，对我国的生态系统造成了极大威胁（徐海根和强胜，2004）。土荆芥较强的入侵性与其强烈的化感作用密切相关，其向环境释放的化感物质干扰周围植物的代谢过程，破坏细胞结构甚至引起细胞凋亡，进而抑制周围植物的生长发育（Jim6nez-Osomio et a1.，1996；胡琬君等，2011；胡忠良等，2015；Chert et a1.，2016）。蚕豆作为蔬菜作物广泛种植于土荆芥入侵的农田（胡琬君等，2012），因此，以蚕豆为受体，分析土荆芥腐解液对其光合特性和保卫细胞活性的影响，对揭示土荆芥的化感作用机制和入侵机制具有重要意义。[前人研究进展]目前，针对土荆芥化感作用的研究主要集中在其挥发性化感物质对根细胞的影响方面（胡琬君等，2011；胡忠良等，2015；Chen et a1.，2016），而关于其对周围植物光合特性影响的研究较少。张红等（2010）、李安奇等（2012）调查发现，土荆芥的凋落物数量较多，其腐解过程释放的化感物质对周围植物的生长发育具有抑制效应。王毅和仪慧兰（2013）、李蕊等（2015）研究认为，蚕豆是观察保卫细胞气孔活动的模式植物，其保卫细胞对许多胁迫因子如甲醛、S02和铝等反应十分灵敏，常被用作评估环境胁迫的受试系统。孙慧群等（2015）研究发现，气孔保卫细胞能灵敏准确地响应环境胁迫，并通过复杂的信号调控改变其膨压，从而使气孔处于最适宜的开闭状态。周健等（2016a，2016b）研究发现，蚕豆叶片保卫细胞能敏感响应入侵植物的化感作用，在土荆芥挥发性化感物质和辣子草水浸提液作用下均表现为活性降低，甚至出现凋亡现象。[本研究切入点]植物生长依赖于光合作用制造的有机物，叶绿素荧光参数能直接反映植物光合系统对光能的吸收和利用情况（王鹰翔等，2017），由于叶片表面的角质层几乎不能透过水分和C02，即气孔开关运动在叶片内外的气体交换尤其是光合作用和蒸腾作用中发挥着关键的调控作用（许大全，2013）。目前，有关土荆芥腐解物对与蚕豆生长发育密切相关的叶绿素特性和气孔特性影响的研究鲜见报道。[拟解决的关键问题]运用盆栽试验和表皮条分析法，分析土荆芥腐解液对蚕豆幼苗生长、叶绿素荧光参数和叶表皮气孔保卫细胞的影响，旨在探讨土荆芥残株腐解的化感作用机制，为揭示土荆芥的入侵机制提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试土荆芥植株采自四川省成都市锦绣大道附近，阴干后备用。蚕豆种子购自成都市龙泉驿区大面镇种子市场，品种为成胡14号。供试土壤取自四川师范大学成龙校区，土壤类型为黄壤。

1.2试验方法

1.2.1腐解液制备 分别称取土荆芥阴干叶片和土壤各0.15 kg，置于塑料桶中，加入6 L蒸馏水，盖上盖子置于25℃的温室中进行腐解處理，处理时间40 d，其间不定期搅拌。处理结束后先用32层纱布过滤2次，滤液再用滤纸过滤1次，得到浓度为25.0mg/L的腐解母液，置于4℃冰箱保存备用。设4个腐解液浓度梯度，即10.0、15.0、20.0和25.0 mg/L，以蒸馏水处理为对照（CK）。

1.2.2材料培养 将捡去植物根系、石头、落叶和枯枝的土壤分装于小花盆（直径7 cm，高度6 cm）中；挑选大小均一、饱满的蚕豆种子，用0.5%KMnO₄溶液消毒15 min，浸种24 h，避光，25℃催芽2～3 d。待种子露白后播种至小花盆中，每盆1粒种子，置于温室中培养，培养条件为光照和黑暗各12 h，温度25℃。

1.2.3幼苗生长指标及叶绿素荧光参数测定 材料培养1周后随机分为5组，分别用不同浓度腐解液和蒸馏水进行浇灌，每盆浇灌10 mL，之后不定期补充水分以保持土壤湿润。每周定期测定植株地上部高度和叶绿素荧光参数，4周后测定叶面积、地上部鲜重和干重。植株高度为用直尺测量蚕豆幼苗植株地上部的高度。鲜重和干重测定：试验结束后，剪取幼苗地上部称取鲜重，然后置于烘箱中105℃杀青，80℃烘至恒重，称重，每处理测定10株。叶面积测定：每株选取顶端第2层的1片叶片，采用AM300叶面积测定仪测量叶面积，每处理测定10株。叶绿素荧光参数测定：选取每株蚕豆顶端第2层的1片叶片，暗处理30 min后，采用FMS一2便携式荧光测定仪测定其实际光化学效率（ФPsⅡ）和最大光化学效率（F_v/F_m）。每组测定10株。

1.2.4细胞毒性试验 采用表皮条分析法，参照周健等（2016a）的方法进行细胞毒性试验。分别取不同浓度土荆芥腐解液6μL，加入装有5 mL表皮缓冲液[50 mmol/L KCl，0.1 mmol/L CaCl₂，0.1 mol/LTris，10 mmol/L 2-（N-morpholino）ethane sulfonicacid（MES），pH 7.0]的EP管中；取生长4～5周蚕豆幼苗完全展开的顶端叶片，用镊子撕取1.0 cm×0.5 cm的下表皮浸入处理液中，每个EP管放置8片，每处理重复5次，以浸泡蒸馏水为对照（CK），置于25℃恒温光照培养箱中培养30 min，分别采用AO/EB染色法和孚尔根染色法检测保卫细胞的活性和核异常率（周健等，2016a，2016b）。具有绿色荧光的为活细胞，具有橘红色荧光的为死细胞。

细胞死亡率（%）=死细胞数/细胞总数×100

细胞核异常率（%）=核异常细胞数/细胞总数×100

1.3统计分析

采用SPSS 17.0对测定参数进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比较（LSD），以Excel2007制图。

2结果与分析

2.1土荆芥腐解液对蚕豆幼苗生长的影响

由表1可知，从第2周起，20.0 mg/L腐解液处理蚕豆幼苗的株高均显著低于CK（P<0.05，下同），处理后第4周，15.0 mg/L腐解液处理蚕豆幼苗的株高也显著低于CK，说明随着处理时间的延长，15.0和20.0 mg/L土荆芥腐解液均能显著抑制蚕豆幼苗苗高生长。随腐解液浓度的增加，蚕豆幼苗叶面积呈先增大后缩小的变化趋势，当腐解液浓度达25.0mg/L时，叶面积较CK下降了7.67%，但各腐解液处理及CK间差异不显著（P>0.05，下同），说明土荆芥腐解液对蚕豆叶片生长的影响不明显。在土荆芥腐解液作用下，蚕豆幼苗地上部生物量发生不同程度的变化，其中15.0 mg/L腐解液处理蚕豆幼苗的地上部鲜重和干重均显著小于CK，分别为CK的81.23%和85.71%，其他浓度的腐解液处理蚕豆幼苗地上部鲜重和干重与CK差异不显著，说明15.0 mg/L土荆芥腐解液对蚕豆幼苗地上部生长具有抑制效应。

2.2土荆芥腐解液对蚕豆幼苗叶绿素荧光参数的影响

由表2可知，不同浓度土荆芥腐解液处理蚕豆幼苗的F_v/F_m和ФPsⅡ在不同处理时间段存在一定差异，但相互问及与CK的差异不显著，说明土荆芥腐解液对蚕豆幼苗的原初光能转化效率影响不明显。

2.3土荆芥腐解液对蚕豆叶片保卫细胞活性的影响

从图1可看出，经土荆芥腐解液处理的蚕豆保卫细胞，其细胞核呈橘红色的保卫细胞比例明显高于CK，CK的大部分保卫细胞核呈亮绿色，说明土荆芥腐解液处理的蚕豆保卫细胞以死细胞居多。统计保卫细胞死亡率发现，土荆芥腐解液处理蚕豆叶片的保卫细胞死亡率总体上随土荆芥腐解液浓度的增加而显著升高（图2-A），说明其细胞活性均明显低于CK，呈浓度依赖关系即土荆芥腐解液可诱导蚕豆保卫细胞死亡。

从图3可看出，25.0 mg/mL土荆芥腐解液处理蚕豆的保卫细胞核形态不规则，表现为核错位、固缩、拉长或降解等畸变特征，保卫细胞核畸变率随腐解液浓度的增加而显著升高（图2-B）；而CK的保卫细胞核位于细胞中间，形态规则。说明土荆芥腐解液对蚕豆保卫细胞核形态具有显著影响。

3讨论

化感作用是外来植物成功入侵的机制之一（Ci-pollini et a1.，2012），扩散到新生境的入侵植物个体比原产地具有更强的化感作用，入侵植物通过根系分泌、淋溶、挥发和腐解等途径将化感物质释放到环境中，改变周围植物的多种生理过程，抑制周围植物生长发育（zhou and Yu，2006），从而在竞争中占据优势地位（cauaway et a1.，2011）。土荆芥为一年生或多年生草本植物，其地上部凋落后必然会进入土壤中腐解并释放化感物质。张红等（2010）研究表明，土荆芥去精油残渣腐解液对受体幼苗生长具有抑制效应，但随着处理时间延长，抑制效应逐渐减弱。本研究结果与其略有不同，在土荆芥腐解液作用下，蚕豆幼苗的叶面积变化不明显，植株高度和生物量整体降低，地上部生长受到抑制，且随处理时间的延长，抑制效应明显增强，可能是本研究供试腐解液来自未经处理的凋落物，其化感物质成分不同所致。

叶绿素荧光参数能很好地反映植物与逆境胁迫的关系。ФPsⅡ是判断植物光合能力的重要指标，是光化学途径中的激发能占进入PSⅡ总激发能的比例，而F_v/F_m是PsⅡ的最大光化學效率（孙园园等，2015），常用来度量叶片PSⅡ反应中心捕获激发能的效率。本研究结果表明，土荆芥腐解液虽然对蚕豆叶片F_v/F_m和ФPsⅡ具有不同程度的影响，但与CK的差异均不显著。因此，土荆芥腐解液对蚕豆叶的光反应影响不明显。

CO₂和水分是植物光合作用的原料，任何影响植物体内CO₂浓度和水分含量的因素都会影响植物的光合效率。气孔对植物C02吸收和水分蒸腾具有调节功能，因此，任何改变气孔功能的因素均会影响光合作用过程和植物产量。侯利钦等（2016）、周健等（2016a）研究发现，气孔保卫细胞可对多种环境刺激作出反应，当受到土荆芥挥发性化感物质胁迫时，气孔保卫细胞活性降低，细胞核出现畸变现象。本研究结果与其相似，蚕豆保卫细胞在土荆芥腐解液的作用下，其活性随着腐解液浓度的增加而显著下降，死亡率急剧上升，且细胞核出现错位、固缩、拉长或降解等畸变特征。

根据本研究结果推测，土荆芥腐解过程中释放的化感物质主要通过影响蚕豆叶片气孔运动而改变其体内的CO₂浓度，从而抑制蚕豆幼苗的生长。

4结论

土荆芥腐解过程中释放的化感物质对蚕豆幼苗的光反应影响不明显，但其较强的细胞毒性能引起叶片气孔保卫细胞发生畸变，活性降低，进而导致幼苗气孔运动受阻，吸收CO₂的能力下降，光合效率降低而影响其生长发育。

致谢：本研究在试验阶段得到四川师范大学细胞生物学专业研究生周健和黄素的大力帮助，谨表谢忱！

（责任编辑 思利华）