独行菜LaAP2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

李艳红 曾卫军 李金玉 葛风伟 朱艳蕾 赵惠新

摘 要：AP2/ERF是廣泛存在于植物中一类重要的转录因子，调控一些参与非生物胁迫相关基因的表达，帮助植物提高逆境胁迫能力。为了深入探讨LaAP2在独行菜耐受低温萌发及幼苗耐受低温生长中的功能，该研究基于前期对独行菜（Lepidium apetalum）转录组数据库分析，克隆获得一个显著上调表达的AP2/ERF家族序列LaAP2。该基因cDNA全长为1 005 bp，编码氨基酸序列包含一个AP2和一个B3结构域，属于AP2/ERF转录因子RAV亚家族。推定的LaAP2蛋白分子量为37.744 67 kD ，等电点为9.49。该蛋白氨基酸序列同亚麻荠、拟南芥、油菜等物种显示出较高同源性，系统进化分析结果表明与拟南芥亲缘关系较近。氨基酸序列分析预测表明，LaAP2基因所编码的蛋白不具备信号肽区段，无跨膜区，不属于分泌蛋白，可能为亲水性蛋白；定位于细胞质的可能性为56.5%，定位于细胞核的可能性为21.7%；其主要二级结构元件为无规则卷曲、延伸链、α螺旋。Realtime PCR分析独行菜幼苗中LaAP2在低温4 ℃处理下的表达，显示LaAP2表达受低温胁迫呈先下降后升高趋势。这表明LaAP2在独行菜幼苗抵抗低温胁迫中起调控作用。

关键词：独行菜，AP2/ERF转录因子，LaAP2基因克隆，序列分析，表达分析，低温耐受，分子生物学

中图分类号：Q943.2

文献标识码：A

文章编号：10003142（2018）06076209

Abstract：AP2/ERF is a kind of important transcription factors widely existing in plants. AP2/ERF regulate the expression of some genes involved in abiotic stress，and help plants improve the ability of adversity stress. We obtained a gene LaAP2 by cloning a significantly upregulated expression AP2/ERF family gene sequence by RTPCR technology，based on the previous analysis of Lepidium apetalum transcriptome database. Bioinformatics analysis of LaAP2 encoded amino acid sequence composition，physical and chemical properties，structure，hydrophobicity，transmembrane region，signal peptide，subcellular localization and secondary protein structure. Realtime PCR was used to detect the expression of LaAP2 gene at 4 ℃ low temperature stress. The result showed that the fulllength cDNA of the gene was 1 005 bp，and the encoded amino acid sequence contains a AP2 and a B3 domain，belonging to the AP2/ERF transcription factor RAV subfamily. The molecular weight of putative LaAP2 protein was 37.744 67 kD and the isoelectric point was 9.49. The amino acid sequence has high homology with Camelina sativa，Arabidopsis thaliana and rape. Phylogenetic analysis showed that the genetic relationship was close to that of A. thaliana. The amino acid sequence analysis showed that LaAP2 gene encoding protein had no signal peptide segments，no transmembrane region，did not belong to the secreted protein. It could be the hydrophilic protein. The possibility of localization in cytoplasm was 56.5%，and in nucleus was 21.7%. The main structural elements were random coil，extending strand and alpha helix. We analyzed the expression of AP2/ERF gene in Lepidium apetalum seedlings under 4 ℃ low temperature stress through Realtime PCR technology，which showed that LaAP2 gene expression was decreased firstly and then increased. The results suggest that LaAP2 play a role in regulating the resistance of low temperature stress in Lepidieae seedling. This study lays the foundation for further study on the function of LaAP2 on the L. apetalum seed germination and seedling growth in tolerance to low temperature.

Key words：Lepidium apetalum，AP2/ERF transcription factor，LaAP2 gene cloning，sequence analysis，expression analysis，low temperature tolerance，molecular biology

獨行菜（Lepidium apetalum）为十字花科独行菜属植物，分布非常广泛。生活在新疆北部的独行菜能耐受早春低温进行种子萌发及幼苗的生长，属典型的早春短命植物（刘彭等，2007）。已有研究发现，独行菜幼苗具有很强的低温耐受能力（赵惠新等，2010；杨娜等，2015），但其耐受低温进行生长的机制目前尚不清楚。转录因子在植物体生长发育和植物抵御生物或非生物胁迫过程中起着重要的调控作用。在不同的胁迫环境下，激活的转录因子也不完全相同（Boulikas，1994）。AP2/ERF类转录因子是广泛存在于植物中的一类转录因子，在逆境诱导基因的表达中起着信号转导的作用（崔喜艳等，2015）。AP2/ERF家族转录因子蛋白序列含有1或2段由60～70个氨基酸残基组成的AP2/ERF结构域，依据结构域的数目和结构域特点不同分为DREB、ERF、AP2、RAV 4个亚族（Sakuma et al，2002）。DREB亚族和ERF亚族仅含有1个AP2结构域，AP2亚族含有2个AP2结构域，RAV亚族含有1个AP2结构域和1个B3结构域（Nakano et al，2006）。DREB亚族可以调节植物抵抗干旱和低温等非生物逆境（Nakashima et al，2000） ；ERF亚族可以调节植物抵抗干旱和高盐等非生物逆境胁迫（Koussevitzky et al，2007）；AP2亚族在植物生长发育过程中具有重要作用（ Boutilier et al，2002 ）；RAV亚族在植物抵御生物和非生物胁迫过程中发挥重要作用（ Sohn et al，2006 ）。

目前，有关独行菜AP2/ERF转录因子的研究未见报道。课题组前期对独行菜种子转录组进行测序，发现27条差异基因序列，被注释为AP2/ERF家族成员基因，相对于萌发低温停滞组，在耐受低温萌发组的独行菜种子中，有一个极显著上调表达的AP2/ERF基因序列，命名为LaAP2 （ 周茜等，2016 ）。在已有研究基础上，本研究采用RTPCR技术克隆获得独行菜LaAP2基因cDNA全长编码序列，用生物信息学分析LaAP2编码的氨基酸序列组成、理化性质、结构域、疏水性、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、二级结构等。荧光定量PCR检测独行菜幼苗中LaAP2基因4 ℃低温胁迫下的表达。本研究为进一步揭示LaAP2转录因子在独行菜幼苗耐受低温中的作用提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

独行菜种子采自乌鲁木齐市鲤鱼山，选择已经成熟并且饱满的种子，室温干燥后，4 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA全长克隆 独行菜幼苗生长10 d后，液氮研磨，Trizol法提取总RNA。根据同源性最高的拟南芥AP2/ERF基因的全长序列，设计引物，扩增独行菜LaAP2基因，引物序列如表1所示。

扩增条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.2 LaAP2序列的生物信息学分析 测出的DNA序列在NCBI （www.ncbi. nlm.nih.gov BLAST）网站上进行分析；利用DNAMAN软件对测序获得核苷酸序列进行拼接和翻译成蛋白质，并进行氨基酸序列的多重比对分析；ORF Finde程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）预测LaAP2蛋白基因的开放阅读框；Conserved Domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白质保守区分析； Protscale（http：//web.expasy.org/cgibin/protscale/protscale.pl）分析编码蛋白的亲疏水性；ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析编码蛋白质的相对分子量、等电点、亲水性等理化性质；TMpred Server（http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）进行LaAP2蛋白跨膜区预测；Signal P（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）对编码蛋白信号肽进行预测分析（葛风伟等，2016）。PSORT II Prediction（https：//psort.hgc.jp/form2.html）对编码蛋白亚细胞定位；SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopm.html）预测LaAP2蛋白的二级结构（肖向文等，2014）；利用MEGA 6.0软件构建LaAP2系统进化树。

1.2.3 荧光定量PCR分析LaAP2基因的表达 独行菜幼苗4 ℃低温分别处理0、6、12、24 h，提取总RNA。参照Realtime PCR试剂盒说明书操作，检测LaAP2基因的表达。所用仪器为ABI StepOne。引物序列如表2所示。

以独行菜幼苗的cDNA为模板，克隆、测序后，得到1 005 bp片段（图2）。ORF Finder程序预测LaAP2蛋白基因的开放阅读框（ORF），发现该基因包含一个1 005 bp完整开放阅读框。DNAMAN软件分析该基因编码334个氨基酸组成的多肽（图3）。

2.2 LaAP2编码产物同源性分析

对LaAP2基因编码的氨基酸序列与8个已知物种AP2氨基酸序列进行多重序列比对（图4）。发现该基因与亚麻荠CsAP2、拟南芥AtAP2、油菜BnAP2、萝卜RsAP2、中华菊头蝠RhsAP2、醉蝶花ThAP2、棉花GhAP2、麻疯树JcAP2氨基酸同源性分别为79%、78%、76%、78%、68%、64%、63%、63%。LaAP2基因编码氨基酸序列N端存在18个氨基酸残基的DNA结合位点“KGVVPQPNGRWGAQIYEK”，C端存在27个氨基酸残基的DNA结合位点“GKVWRFRYSYWNSSQSYVLTKGWSRFV”，两处氨基酸残基序列在不同植物中具有一定的保守性。

2.3 独行菜LaAP2理化性质预测及结构域分析

ExPASy ProtParam预测表明，获得的LaAP2编码氨基酸的理论分子量37.744 67 kD；理论等电点pI为9.49；蛋白质分子式为C1665H2638N482O505S8，不稳定系数为36.76，表明该蛋白为稳定蛋白。脂溶指数为73.77，总平均亲水性的数值为-0.587，预测LaAP2为亲水性蛋白。

Conserved Domains进行蛋白质保守区分析，发现LaAP2基因编码氨基酸序列含有一个AP2（63～118位氨基酸）结构域和一个B3（187～293位氨基酸）DNA结合结构域（图4），属于典型的AP2/ERF类转录因子RAV亚家族基因。

2.4 独行菜LaAP2的亲水性/疏水性

Protscale分析结果（图6）表明，独行菜LaAP2亲水性部位较多，疏水部位少。LaAP2蛋白的亲水性/疏水性的最大值为176位的Val 1.889（疏水性最强），最小值为328位的Cys -3.233（亲水性最强）。总体而言，与前面氨基酸理化性质预测的结果一致，LaAP2蛋白属于亲水性蛋白。

2.5 独行菜LaAP2的跨膜区、信号肽及亚细胞定位

TMpred Server进行LaAP2蛋白跨膜区预测，表明该蛋白不具有跨膜区，属于非跨膜蛋白。

Signal P对LaAP2蛋白信号肽进行预测分析，图7结果显示，LaAP2蛋白不具有信号肽，表明LaAP2不是一个分泌蛋白。

PSORT Ⅱ Prediction亚细胞定位结果显示，LaAP2定位于细胞质的可能性最高，为56.5%；其次是细胞核，为21.7%；细胞骨架为13%；过氧化物酶体和液泡都为4.3%。LaAP2可能在细胞核或细胞质中发挥功能。

2.6 独行菜LaAP2蛋白二级结构预测分析

SOPMA程序对独行菜LaAP2的二级结构进行预测。图8结果顯示，LaAP2蛋白的二级结构包含24.55%的α螺旋（82处）、29.94%的延伸链（100处）、8.98%的β折叠（30处）、36.53%的无规则卷曲（122处）。

2.7 系统进化树分析

选取GenBank上7个物种的AP2序列，利用MEGA6.0软件构建进化树（图9），发现独行菜LaAP2与拟南芥AtAP2（NP_189201）形成的小分支，再和花椰菜BoAP2（XP_013599419）与油菜BnAP2（XP_013644813）分支组成一个大分支，而亚麻芥ClAP2（XP_010495155）、芜菁BrAP2（XP_009148531）、醉蝶花ThAP2（XP_010528045）聚在一起位于另一个分支中。LaAP2与拟南芥的同源性最高，可信度达97%。

2.8 独行菜幼苗冷胁迫下LaAP2基因表达分析

独行菜幼苗4 ℃处理6 h后，LaAP2表达量只有对照的0.35倍，12 h后表达量是对照的0.16倍，24 h后表达量比12 h时表达量提高了8.4倍，是对照的1.4倍（图10）。

3 讨论

当植物受到干旱、高盐、低温等生物或非生物刺激后，首先会激活脱落酸、乙烯等信号途径，进而激活转录因子的表达，再通过转录因子结构域内的反式作用元件特异性结合到下游靶基因启动子区域的顺式作用元件上，来激活或抑制下游功能基因的表达来完成调节作用（崔喜艳等，2015）。AP2/ERF是植物中一个大的转录因子家族。随着目前测序技术的快速发展，已有多种植物的AP2/ERF转录因子被分离鉴定出，如拟南芥、玉米、水稻、大豆等（崔喜艳等，2015）。它们在调控植物抵御干旱、高盐、低温等非生物胁迫中的功能不断被证实（Wang et al，2011；Abogadallah et al，2011；Shinwari et al，1998））。

由于AP2/ERF转录因子在植物应对低温胁迫响应方面具有重要的调控作用，该研究克隆了独行菜AP2/ERF转录因子家族中一个低温处理后显著上调表达的转录因子LaAP2。获得的LaAP2 cDNA全长序列长度为1 005 bp。生物信息学分析，LaAP2基因编码334个氨基酸。 LaAP2编码氨基酸序列具有一个AP2结构域和一个B3结构域，属于AP2/ERF转录因子中RAV亚家族。推定的LaAP2蛋白分子量为37.744 67 kD，等电点为9.49。该蛋白氨基酸序列同亚麻荠、拟南芥、油菜等物种显示出较高同源性，系统进化分析表明与拟南芥亲缘关系较近。氨基酸序列分析预测表明，LaAP2基因所编码的蛋白不具备信号肽区段，无跨膜区域，不属于分泌蛋白，可能为亲水性蛋白，其主要二级结构元件为无规则卷曲、延伸链和α螺旋，定位于细胞质中的可能性高于细胞核中。转录因子一般存在于细胞核内（阮先乐等，2017），LaAP2蛋白存在的具体位置在下一步实验中仍需进一步通过亚细胞定位明确。

低温作为外界的一种非生物胁迫对植物的生长具有不利的影响。为了抵抗这种胁迫，植物具有响应胁迫刺激的复杂的调节途径（崔喜艳等，2015）。植物在受到低温胁迫后，首先激活的是响应低温胁迫的一些转录因子，进而激活下游效应基因的表达，通过这样一个过程来应对低温胁迫对植物带来的损伤（崔喜艳等，2015）。荧光定量PCR分析了4 ℃低温处理不同时间独行菜幼苗中LaAP2转录因子基因的表达，显示LaAP2表达量表现出先降低后升高的现象。这表明低温胁迫对独行菜幼苗中LaAP2表达具有重要的影响，LaAP2可能在独行菜耐受低温生长中起着一定的调控作用。结合前期课题组对独行菜表达谱的分析（周茜等，2016；周茜，2016），推测独行菜中LaAP2转录因子与种子萌发、幼苗发育及耐受低温胁迫反应密切相关。该研究为进一步探讨LaAP2在独行菜种子耐受低温萌发及幼苗生长中的具体功能奠定了基础。

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