运用BioID技术筛选水稻GS3互作蛋白

杜荣裕 周泽娇 冯嘉琳 刘赛 阳辉勇 李洪清

摘 要：水稻异源三聚体G蛋白系统中的非典型γ亚基GS3，是一个控制籽粒大小的主效数量效应基因座，在调节籽粒大小中发挥负调控因子的功能。BioID （proximitydependent biotin identification） 为邻近蛋白标记技术，其工作原理是生物素连接酶能使其周围的蛋白带上生物素，同时生物素又能和链霉亲和素紧密结合，所以能够利用链霉亲和素偶联的磁珠富集目标蛋白。该技术具有灵敏、高效和周期短等特点，为筛选互作蛋白提供了新方法。为了解析GS3的蛋白调控网络，该研究以水稻原生质体为材料，采用BioID 技术对GS3在水稻中的互作蛋白进行了筛选。Westernblot结果表明：融合蛋白BirAGGS3在原生质体中成功表达并生物素化GS3邻近蛋白。使用链霉亲和素磁珠富集生物素化后的蛋白，并进行蛋白质谱测序，获得了与GS3邻近的可能存在直接或间接互作的蛋白。将获得的蛋白进行功能富集与注释，并构建蛋白-蛋白互作网络。对部分蛋白进行了BiFC 验证，发现GS3可能与ICL、PPDK、RPN7和RH15发生相互作用，涉及能量代谢的调节、种子淀粉物质的储存、泛素-蛋白酶体系统以及凋亡途径等生物过程。

关键词：BioID，GS3，水稻，籽粒大小，互作蛋白

中图分类号：Q943

文献标识码：A

文章编号：10003142（2018）06077110

Abstract：GS3，encoding the noncanonical γ subunit of heterotrimeric G proteins system in rice，is a major quantitative trait locus for grain size in different rice varieties，serving as a negative regulator in seed or organ size. Newlydeveloped BioID （proximitydependent biotin identification） system，which detects proximal proteins in vivo，has been successfully applied in different species for its features of sensitivity，high efficiency and fast speed. And the mechanism of BioID is that the biotin ligase，the core component，could attach biotin to the proximal proteins，and the biotin also connects tightly with streptavidin，therefore，the beads coupled streptavidin could be utilized for enriching the target proteins. In this study，we screened proteins interact directly or indirectly with GS3 in rice protoplasts by BioID method. The results of Westernblot showed that fused protein BirAGGS3 expressed and biotinylated the proximal proteins of GS3 in the protoplasts successfully. Biotinylated proteins were enriched by beads coupled streptavidin and the Mass Spectrometry sequencing performed on it. Then，the function of proteins has been annotated and enriched，meanwhile，proteinprotein interaction graph was established. Some of the candidate proteins were confirmed by BiFC，indicating the possible interaction between ICL，PPDK，RPN7 and RH15，and the engagement of GS3 in regulation of energy metabolism，stock of starch，ubiquitinproteasome system and apoptotic pathway . The above results will facilitate the elucidation of the regulation network of the function of GS3.

Key words：BioID，GS3，rice，grain size，interaction proteins

在動植物中，异源三聚体G蛋白由α、β和γ三个亚基组成，是非常重要的信号调节因子。在植物中，异源三聚体G蛋白的信号通路在生长发育与抗逆生理中起着不可替代的作用（Stateczny et al，2016）。相比哺乳动物异源三聚体G蛋白信号网络，植物异源三聚体G蛋白家族成员的数量、结构，以及其上游受体，下游效应蛋白的成员组成，乃至整个G蛋白的循环机制都表现出非典型性（Trusov & Botella，2016）。在植物中还没有统一的异源三聚体G蛋白网络模型，如在拟南芥中发现了一个类似哺乳动物的7次跨膜受体类似蛋白AtRGS，但在水稻中没有找到7次跨膜同源受体蛋白。令人意外的是，水稻中发现了一个11次跨膜受体COLD1，与异源三聚体G一起调节Ca2+通道，抵御严寒（Stateczny et al，2016）。最新观点认为受体类激酶在G蛋白信号网络中起首要作用（Choudhury & Pandey，2016）。

异源三聚体G蛋白中的非典型γ亚基GS3在水稻谷粒大小调节中起着重要作用，在水稻增产方面展现巨大的潜力。非典型的γ亚基由N端一个保守的γ类结构域、预测的跨膜域和C端半胱氨酸富集结构域组成（Botella，2012）。GS3的γ类结构域负调节谷粒大小，而其C端的尾部又反过来抑制N端的功能。这导致GS3蛋白的头尾出现了功能上的“博弈”。GS3头部功能越强，对谷粒长度抑制越明显。当GS3的γ类结构域突变或者缺失，不能与β亚基形成二聚体发挥作用，谷粒最长；完整的GS3蛋白尾部抑制γ类结构域的负调控功能，减弱基因效应，粒长中等；当只有γ类结构域，基因所起的抑制效应最强，粒长最短（Mao et al，2010）。

BioID（proximitydependent biotin identification）为邻近蛋白标记技术，该方法可以将物理空间上靠近诱饵蛋白附近的蛋白标记上生物素，用以作为蛋白质互作的证据。该技术的核心功能组件是生物素连接酶。在大肠杆菌中，生物素连接酶BirA识别的底物具有特异性，其作用的蛋白包含一段特定的氨基酸序列，并将其生物素化。如果将BirA的118位进行突变（R118G，BirA*），会极大降低其识别底物的特异性，其作用的蛋白不需要带有特定的氨基酸也能被生物素化（Kwon & Beckett，2000）。BioID最早应用于哺乳动物细胞中（Roux et al，2012）。除了应用于动物细胞中，BioID技术也可用于单细胞生物中，如布氏锥充（Trypanosoma brucei）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）。此外，BioID技术还可用于宿主-病原体系统的研究中，如HIV1互作蛋白的研究（Varnaite & Macneill，2016）。本实验室以水稻原生质体为材料，通过研究影响BioID在植物中应用的多种因素，建立了适合在水稻中使用BioID系统 （Lin et al，2017）。

BioID技术的操作主要包括以下流程：（1）构建带有融合蛋白BirAG的目的蛋白表达载体，并转化植物原生质体，瞬时表达融合BirAG的目的蛋白。（2）在有生物素的条件下进行孵育，使目的蛋白邻近的其他蛋白被生物素化。（3）提取原生质体总蛋白与链霉亲和素磁珠进行共孵育，被生物素化的蛋白即可吸附在磁珠上。（4）通过清洗、洗脱等步骤获得富集的生物素化蛋白，利用westernblot 以及质谱分析的方法，可以对被生物素化的蛋白进行鉴定（Lin et al，2017）。Varnaite & Macneill（2016）研究认为，在诱饵蛋白附近10 nm范围内的蛋白，包括直接、间接相互作用的都会被生物素化而被鉴定出来。

GS3调控种子大小的功能已经非常明确，但是关于GS3调控机制的研究比较少见。本研究采用BioID方法，一种不同于现有的酵母双杂交的方式，筛选GS3互作蛋白，为GS3相关调控网络的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

水稻“中花11”（Oryza sativa）由本实验室保存。KOD FX聚合酶购自东洋纺（上海）生物科技有限公司。限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自大连TaKaRa生物有限公司。质粒抽提试剂盒为Axygen公司产品。大肠杆菌感受态菌株JM109为本实验室保存。BioID载体由本实验室保存（Lin et al，2017）。引物合成由上海生工生物技术有限公司完成。所用链霉亲和素磁珠由Solulink公司提供。抗BirA兔源多抗为LifeSpan BioSciences公司生產。二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，由Proteintech公司生产。RIPA强蛋白提取液、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素为碧云天公司生产。测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。蛋白质谱测序由深圳市微纳菲生物技术有限公司进行。

1.2 方法

1.2.1 构建水稻GS3 BioID载体 提取水稻RNA并反转录成cDNA，运用PCR技术对GS3 CDS进行扩增。所用引物为GS-F：GAAGATCTATGGCAATGGCGGCGGCGCCCCGGCC；GS-R：GGACTAGTTCACAAGCAGGGGGGGCAGCAACGAGGGAC。下划线标记的序列为引入的BglⅡ和SpeⅠ的酶切位点。退火温度为60 ℃，延伸1 min，35个循环，回收PCR产物，进行酶切与纯化。

BioID的载体如图1所示，用BamHⅠ和SpeⅠ 进行双酶切，变性，并与获得的GS3纯化进行连接，转化大肠杆菌，提取阳性菌株质粒，测序。

1.2.2 水稻原生质体的转化 原生质体的转化参照Yang et al（2014）的方法，首先将pUbi∷BirAG∷GS3转化进400 μL水稻原生质体中（原生质体浓度约为2×106 个·L1），然后转入pUbi∷BirAG作为阳性对照，最后在培养液中加入外源生物素（终浓度为50 μmol·L1）培养24 h。同理，再转化一组pUbi∷BirAG∷GS3，以不加入生物素一组为阴性对照。

1.2.3 蛋白质的提取与鉴定 （1）原生质体培养24 h后，用3 000 r·min1，3 min收集原生质体；用0.6 mol·L1甘露醇洗涤原生质体，再次收集原生质体；加入700 mL RIPA强蛋白提取液，剧烈震荡，13 000 r·min1在4 ℃下离心20 min，取上清，于-20 ℃储存备用。（2）取15 μL的蛋白样品在12%SDSPAGE上分离后，用湿法转膜法将分离的蛋白转至PVDF膜上。 电转完毕后，使用抗BirA兔源多抗做一抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体作为二抗，进行 Westernblot进行分析，观察BirAG蛋白表达结果。同理，用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素作为抗体，检测标记上生物素的蛋白。

1.2.4 生物素化蛋白质的富集 （1）磁珠处理：涡旋震荡原始磁珠瓶1 min，利于成团的磁珠分散；取20 μL磁珠于EP管中；磁力架上放置2 min，去上清；加入RIPA强1 mL，震荡分散磁珠，室温摇摆5 min；重复以上清洗步骤2次；磁珠与蛋白样品孵育4 ℃过夜；2% SDS 清洗1次，RIPA清洗2次磁珠，将磁珠样品悬浮在PBS缓冲液，送往公司进行蛋白质谱测序。（2）蛋白质谱测序：参照Wisniewski et al（2009）的方法，采用胰蛋白酶处理富集生物素化蛋白的磁珠，将其制成多肽溶液进行LCMS/MS分析（质谱仪型号为Triple TOF 5600 LCMS（AB SCIEX））。采用Maxquant软件进行数据加工处理和检索分析，数据库为Uniprot下物种为Oryza sativa subsp. japonica蛋白数据库。检索参数设置如下：半胱氨酸烷基化为碘乙酰胺、可变修饰为甲硫氨酸氧化和蛋白N端乙酰化、胰蛋白酶酶解，二级质谱匹配容差为0.004%，多肽假阳性率控制为1% FDR，蛋白假阳性率控制为1%。

1.2.5 BiFC验证互作蛋白 挑选相关的功能基因进行克隆，构建BiFC载体。进行原生质体转化，12 h后于LSM 800激光共聚焦显微镜下观察荧光。所用载体为pSAT6cEYFPC1B（3108）和pSAT6nEYFPC1（E2884）。所用到的引物如下（下划线标出酶切位点，并标注对应的内切酶）：ICLF GAAGATCTATGTCGTCGCCGTTCTCCGTGCCATCT（Bgl Ⅱ）； ICLR CGGAATTCCATCCTGGATTTGGCAAGAACATGGCT（EcoR Ⅰ）；PPDK1F GAAGATCTATGCCGTCGGTTTCGAGGGCCGTGTGC（Bgl Ⅱ）；PPDK1R GCTCTAGAGAGGAGCACCTGAGCTGCAGCTAGCCT（Xba Ⅰ）；RPN7F GAAGATCTATGGACGGCGGCGTAGGCGAGGAAGGG（Bgl Ⅱ）；RPN7R CGGAATTCCAGGTCAATGACTCGTGATAGCTTCTG（EcoR Ⅰ）；RHD3F GAAGATCTATGGACGCCTGTTTTTCAACACAGCTT（Bgl Ⅱ）；RHD3R CGGAATTCGTGTGCAATCGGGCTTGAATATTCGGGT（EcoR Ⅰ）；RH15F CGAGCTCAAAATGGGCGAAGCTGAGGTCAAGGACAAC（Sca I）； RH15R GCAGTACTCGAAGGCATATATGTCGAAGTATCAAT（Xba Ⅰ）。

2 结果与分析

2.1 BirAGGS3蛋白在水稻原生质体中的蛋白质表达

将pUbi∷BirAG质粒转化进原生质体中，加入生物素进行培养，作为阳性对照；将pUbi∷BirAG∷GS3质粒转化两份原生质体，一份添加生物素，一份不添加，分别作为实验组和阴性对照组。孵育24 h后，提取原生质体总蛋白，使用兔抗BirA多克隆抗体为一抗进行Westernblot检测，其中BirAG预测大小为35.29 kDa，BirAGGS3融合蛋白预测大小约为59.62 kDa，与实验结果相符。实验结果如图2所示，表明BirAGGS3融合蛋白成功表达。

2.2 GS3邻近蛋白在水稻原生质体中的生物素化情况

取三组蛋白样品，以辣根过氧化物酶标记链霉亲和素进行Westernblot检测（图3）。图3结果显示，阳性对照的BirAG组出现多条条带，表示其能够生物素化多种水稻中的蛋白。BirAGGS3在没有添加生物素的情况下，只出现一条条带，该条带为水稻内源生物素化的蛋白。说明在没有添加生物素的培养液中，BirAGGS3蛋白成功表达但是没有对周围蛋白进行生物素化。BirAGGS3 在添加生物素的培養液中，条带数增加，并且出现了特有的条带，说明BirAGGS3可以使得邻近蛋白的生物素化。这表明 BirAGGS3融合蛋白成功生物素化直接或间接相互作用的蛋白。

2.3 GS3邻近蛋白的质谱鉴定结果

各组的生物素化蛋白经过磁珠富集后进行，经过酶切等后续处理，然后进行LCMS/MS分析。质谱采集到的原始wiff图谱文件，采用Maxquant软件进行数据加工处理和检索分析，将获得的蛋白制成韦恩图（图4）。经过BirAG组和GS3（-）组的过滤，我们发现实验组GS3（+）特有的蛋白有101个，将这些蛋白导入网站https：//www.ebi.ac.uk/QuickGO，进行基因本体注释（图5）。图5结果显示，GS3邻近蛋白参与多个生物学功能，如多种氮类化合物、氨基酸和多肽等的代谢过程。细胞组分方面，GS3邻近蛋白主要集中在细胞质中，在叶绿体中也有富集。分子功能方面，GS3相关蛋白主要有结构分子活性，同时依赖小分子来调节功能，例如结合各类核苷酸、阴离子等。按照其分子功能，将得到的蛋白进行分类，如表1所示。将这些蛋白导入STRING网站 （http：//stringdb.org，互作蛋白/基因检索工具），构建GS3邻近蛋白质互作网络（图6）。这表明GS3邻近的蛋白之间也存在许多实验证明的或者计算机预测的相互作用。同时可以看出GS3邻近蛋白在核糖体、卟啉和叶绿素代谢，脂肪酸伸长，乙醛酸和二羧酸代谢，光合作用等途径发生富集。

2.4 GS3与其邻近蛋白互作的检测

挑选了ICL（Isocitrate lyase，异柠檬酸盐裂解酶）、PPDK1 （Pyruvate phosphate dikinase 1，丙酮酸磷酸双激酶）、RPN7（26S蛋白酶体的非ATP酶的调节亚基6，26S proteasome nonATPase regulatory subunit 6）、RH15（DEADbox ATPdependent RNA helicase 15，DEAD盒ATP依赖的RNA解旋酶15）和RHD3 （ROOT HAIR DEFECTIVE 3，根毛缺陷蛋白3），通过双分子荧光互补技术，对过滤后的蛋白进行互作验证。5个蛋白编号在表2 中已经备注，并用方框标记。扩增这5个基因的CDS，并构建BiFC表达载体。BiFC结果如图7所示，ICL、PPDK、RPN7和RH15与GS3蛋白发生互作。

3 討论与结论

通过BioID成功得到了101个候选蛋白，本研究挑选了5个进行BiFC初步验证，鉴定到4个可能与GS3互作的蛋白，分别为ICL、PPDK、RPN7和RH15，这些蛋白涉及多个植物生长生理过程。作为一种快速筛选可能的互作蛋白的方法，BioID 不同于酵母双杂交，它可以在细胞中检测到临近蛋白，也可以检测瞬时或弱结合蛋白。

ICL和MS（苹果酸合酶，Malate synthase）是乙醛酸循环中起关键作用的限速酶。油料种子通过乙醛酸循环，将脂肪转化为糖，这对种子的萌发、萌发后的生长有着重要的意义。水稻种子的主要成分是淀粉，所以水稻种子的乙醛酸循环可能参与其他生理反应。在缺氧环境下，植物的呼吸作用受到抑制或阻碍，于是通过乙醇发酵途径产生NAD+。乙醇发酵途径能产生许多毒性物质，例如乙醛。正常有生长情况下，ICL和MS几乎检测不到，而在水淹条件下迅速上升（Lu et al，2005）。该结果预示GS3可能参与逆境生理。

PPDK1催化丙酮酸和PEP（Phosphoenolpyruvate，磷酸烯醇式丙酮酸）之间的可逆反应。其中，丙酮酸为氨基酸和脂肪酸的合成提供碳骨架。PEP

经过羧化反应后形成OAA（α酮戊二酸）进入三羧酸循环，能进入糖异生途径。此外，PEP也能与4-磷酸赤藓糖反应形成莽草酸，莽草酸参与木质素、生物碱合成，同时也是次生代谢中的重要物种。水稻中，PPDK1基因在叶肉细胞中表达量不高，但在籽粒中却大量表达（Kang et al，2005）。Chastain et al（2006）研究指出，PPDK1是在水稻种子发育过程中而不是在种子发育成熟后发挥功能，其主要通过磷酸化来调控其活性，同时蛋白质降解途径也参与其中。PPDK1的表达量或者活性降低，会导致籽粒垩白度增加，粒重减轻（Kang et al，2005； Wang et al，2015）。Lappe et al（2018）研究发现，在玉米中PPDK1基因通过调控糖酵解通路，影响胚乳的品质。由此可推测，GS3参与调控胚乳糖代谢途径。

依赖ATP提供的能量，DEADbox RNA解旋酶（RNA helicases，RHs）几乎参与RNA转录到衰变的所有生物过程，在植物的生长发育、抗逆反应中起重要作用（Linder & FullerPace，2015）。在水稻中，凋亡抑蛋白5（Apoptos isinhibitor5，API5）与AIP1 （API5INTERACTING PROTEIN1）和AIP2 （API5INTERACTING PROTEIN2）形成一个转录复合物，诱导半胱氨酸蛋白酶1（Cysteine Protease 1，CP1）的表达。“API5AIP1/2CP1”调控水稻绒毡层降解过程中的细胞凋亡进程 （Li et al，2011）。其中，AIP1与AIP2实质上是ATP依赖的DEADbox RNA解旋酶成员，分别为OsRH56与OsRH15。在拟南芥中，三聚体G蛋白的β亚基下游信号网络中，发现包括DEADbox蛋白在内的DNA/RNA解旋酶参与其中（Khatri et al，2017）。在水稻中，Gα亚基参与了GA通路，其突变体dl发生矮化，而OsRH2和OsRH34双突变体表现出了类似的表型，这暗示DEADbox解旋酶可能参与了G蛋白介导的GA信号通路 （Huang et al，2016）。因此，我们猜想AIP2也有可能参与到GS3下游网络调控。

泛素-蛋白酶体降解系统（ubiquitinproteasome system，UPS）选择性地降解蛋白质，维持类蛋白质的平衡，由此参与到植物的生长发育与抗逆生理中。26S蛋白酶体由1个20S核心颗粒（CP）和2个19S调节颗粒（RP）组成。RPN7是构成19S颗粒装配的必要亚基，作为盖子的组成部分（Collins & Goldberg，2017）。在G蛋白信号网络中，可以发现26S蛋白酶体参与其中。XLG2直接与FLS2和BIK1相互作用，它与AGB1和AGG1/2的功能一起减弱蛋白酶介导的对BIK1的降解，使其达到最佳的免疫激活（Liang et al，2016）。由此推测，GS3可能可以参与到泛素-蛋白酶体降解系统，进而传递信号。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，发现泛素连接酶SCFUcc1作为代谢开关，调节乙醛酸循环（Nakatsukasa et al，2015）。结合PPDK1与ICL生物学功能，猜测GS3直接参与糖酵解、TCA与乙醛酸循环的调节。

本研究通过BioID技术，成功捕获了GS3的邻近蛋白，并构建了这些蛋白的互作网络。BiFC结果表明在选取的5个GS3邻近蛋白中，有4个蛋白与之互作，分别为ICL、PPDK、RPN7和RH15，涉及能量代谢的调节、种子淀粉物质的储存、泛素-蛋白酶体系统以及凋亡途径等生物过程，为构建植物异源三聚体G蛋白网路提供了线索，也为水稻的增产提供了新思路。由于本研究实验系统采用的是水稻叶肉原生质体，捕获的蛋白可能具有局限性。我们正在探索以整株转基因植物为材料进行BioID 技术，以便能在不同的组织、细胞类型中更全面地筛选目标蛋白的互作蛋白。

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