两株茶叶籽水浆发酵杆菌的分离鉴定及其数量动态分析

任翠娟 姜金仲 王自布 穆安德 王兴春 黄燕芬

摘要：【目的】鉴定茶叶籽水浆发酵分层过程中后期的微生物种类，并研究其数量动态，为优化茶叶籽油生物发酵生产工艺及揭示茶叶籽水浆发酵分层机理提供参考依据。【方法】利用添加放线菌酮的MRS固体培养基对发酵5 h的茶叶籽水浆发酵液划线培养，并进行微生物分离与提纯；通过形态学观察、酶学反应、碳源反应、16S rDNA及pheS基因测序分析、系统发育树分析，对分离的微生物进行鉴定；再利用涂布培养法观察菌体的数量动态变化情况。【结果】从茶叶籽水浆发酵液中分离纯化获得两株菌株，分别编号为JJZ12和JJZ21。两株菌株的菌落均呈圆形，白色，凸起，表面光滑湿润，边缘整齐。其中，JJZ12菌株的菌体呈杆状，大小0.6～1.2 μm×1.0～3.0 μm，成对或短链排列，革兰氏阳性；JJZ21菌株的菌体大小为0.5～0.7 μm×0.8～1.7 μm，单个或成对排列，革兰氏阳性。经鉴定，JJZ12和JJZ21分别为Gluconacetobacter liquefaciens（产液葡糖酸醋杆菌）和Lactobacillus plantarum subsp. plantarum（植物乳杆菌）的一个菌株；结合本研究编号，两种杆菌分别命名为G. liquefaciens JJZ12和L. plantarum subsp. plantarum JJZ21。在茶叶籽水浆发酵过程中，发酵液中JJZ12和JJZ21菌体的总数量在发酵5 h后逐渐快速增加，至15 h时达最大值，之后又逐渐回落进入稳定状态。【结论】JJZ12和JJZ21两株杆菌是茶叶籽水浆发酵中后期起主要作用的发酵微生物，该结论为解释茶叶籽水浆发酵分层现象的发生机理提供了理论依据。

关键词： 茶叶籽水浆；杆菌；发酵工艺；菌体数量动态

中图分类号： S794.4；TS222.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1603-09

0 引言

【研究意义】茶叶籽（Camellia sinensis）油生物发酵法生产工艺是近年来报道的一种茶叶籽油生产新工艺（姜金仲等，2013），主要由茶叶籽清洗浸泡、加水打浆、茶叶籽水浆发酵、取发酵液顶层加热生产毛油等环节构成。利用该工艺以茶叶籽为原料可同时生产获得茶叶籽油、茶叶籽淀粉和茶叶籽酵素3种产品，极大提高了茶叶籽资源的利用率；此外，由于该工艺首先从茶叶籽中分离出茶叶籽油脂体，再以茶叶籽油脂体为原料生产茶叶籽油，避免了茶叶籽其他成分对茶叶籽油的污染，简化了茶叶籽毛油的精炼程序，从而提高了茶叶籽油中天然活性成分的含量，有效改善了茶叶籽油的营养品质（Jiang et al.，2013）。茶叶籽油生物发酵生产工艺的核心是茶叶籽水浆发酵分层（姜金仲等，2015），指茶叶籽水浆（用茶叶籽仁加水粉碎过滤后的滤液）在适当的条件下经微生物发酵可以分为上、中、下3层：上层为茶叶籽油脂体，取出用于生产茶叶籽油；中层为发酵液，用于生产茶叶籽酵素；下层为茶叶籽淀粉，用于生产茶叶籽淀粉（姜金仲等，2017a）。可见，微生物在茶叶籽水浆分层过程中起着重要作用。因此，阐明茶叶籽水浆发酵液中的微生物种类及其在发酵过程中的作用特性，对于优化茶叶籽油生物发酵生产工艺及揭示茶叶籽水浆发酵分层机理具有重要意义。【前人研究进展】由于茶叶籽油生物发酵工艺研发时间较短，目前关于该工艺发酵微生物的研究报道很少。姜金仲等（2017b）首先从该工艺发酵液中分离出茶叶籽酵母，并对其在茶叶籽水浆发酵分层过程的作用特性进行研究，结果表明，发酵前期（前5 h）起主要发酵作用的微生物是茶叶籽酵母（Meyerozyma caribbica JJZ11），该酵母在茶叶籽水浆发酵液中的数量在发酵5 h后开始减少，发酵至10 h时已基本消失。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）属于乳酸菌科中的乳杆菌属，有120多个种（Rantsiou et al.，2006），研究者们已利用DNA多态性技术成功分离鉴定出173株乳酸杆菌（Amr and Jabay，2004）。产液葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter liquefaciens）是葡糖杆菌属（Gluconobacter）的1个种（冯静等，2010）。Tanner等（1999）利用16S rDNA序列分析成功鉴定了G. liquefaciens qzr14；Wang等（2017）从土壤中分离出G. liquefaciens的1个菌株，命名为qzr14，并证明其可增加黄瓜幼苗鲜重及干重。【本研究切入点】鉴别茶叶籽水浆发酵微生物种类是优化茶叶籽油生物发酵生产工艺的核心问题，虽然目前已知茶叶籽水浆最佳发酵时间为16 h（姜金仲等，2017a），发酵5 h前茶叶籽酵母是主要微生物，但发酵5 h后发酵液中主要微生物种类的鉴定尚无相关报道。【拟解决的关键问题】以发酵5 h的茶叶籽水浆为材料，从中分离纯化发酵微生物，利用基因测序及碳源反应观察等方法，鉴定纯化微生物的种类，以确定茶叶籽水浆发酵5 h后是哪种微生物接替了茶叶籽酵母的发酵作用，为优化茶叶籽油生物发酵生产工艺及揭示茶叶籽水浆发酵分层机理提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

茶叶籽主要采摘自湖北省随州市广水市福建大白茶品种，将带内种皮茶叶籽仁放至土炕烘干，其水含率8.4%、油含率（索氏抽提法）26.2%。主要试剂：石油醚（德州润昕实验仪器有限公司）、蛋白胨（安琪酵母股份有限公司）、牛肉膏（德州润昕实验仪器有限公司）、酵母膏（广州市昕迪实验器材有限公司）、磷酸氢二钾（佛山市顺德区魏玛化工有限公司）、醋酸钠（北京迪马欧泰科技发展中心）、琼脂（安琪酵母股份有限公司）。主要仪器设备：XSP-9CA光学显微镜（上海光学仪器一厂）、PHSJ-4A pH计（西安禾普生物科技有限公司）、GL124-1SCN电子天平[季尔国际贸易（上海）有限公司]、TG16-WS高速离心机（济南来宝医疗器械有限公司）、ET-7打浆机（湖北武汉宏旭机械设备责任有限公司）。

放线菌酮溶液配制（鲁战会等，2002）：准确称取所需放线菌酮，用75%酒精配制成100 mg/mL的放线菌酮溶液，存放于0～4 ℃冰箱中。MRS固体培养基参照梅乐和等（2000）的方法配制，同时每1000 mL培养基中添加100 ?L放线菌酮溶液，并在压力1.05 kg/cm2、121 ℃高压条件下灭菌30 min。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 茶叶籽水浆发酵液制备 称取茶叶籽仁100 g，按照1∶1比例加清水，于20 ℃条件下浸泡16 h，将浸泡好的茶叶籽清洗后加水（茶叶籽：水=1∶3）进行两轮打浆、过滤得滤液（茶叶籽水浆），把滤液置于35 ℃恒温发酵5 h左右，滤液开始分为上、中、下3层备用。

1. 2. 2 茶叶籽水浆发酵杆菌分离与纯化 根据本课题组前期的分离试验结果，茶叶籽水浆中早期有茶叶籽酵母（姜金仲等，2017b），为过滤茶叶籽酵母，分离培养时使用添加放线菌酮的MRS培养基。在茶叶籽水浆发酵至5 h时，从发酵液中层取样，稀释10000倍，取0.2 mL稀释液涂布在添加放线菌酮的MRS培养基上，重复3次；将培养皿倒置于生化培养箱内，25 ℃培养48～72 h。待菌落形成后，记录菌落形态，用接种环或接种针挑取单个菌落，接种至MRS斜面培养基上，25 ℃培养24～48 h。仔细观察革兰氏染色细胞形态特征，镜检是否为纯菌种，若镜检存在杂菌则划线接种于琼脂培养基上，再次挑取单菌落，直到镜检不存在混杂菌为止。将已经分离纯化的菌株转接至斜面培养基上，贴好标签，于4 ℃下保藏备用。

革兰氏染色：用接种针挑取培养24 h的菌落涂片，碘液媒染1 min后革兰氏染色，乙醇脱色20 s后，40倍镜下观察颜色变化。

菌落观察：将培养好的培养基放在显微镜下，5倍倍率观察菌落的形态及培养基底部颜色（马国善，2018），并拍照。

1. 2. 3 分离获得菌株常规鉴定 按照《伯杰氏细菌鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）中的方法对分离纯化获得的菌株进行形态学观察、主要生理生化测定及酶学反应。其中，形态学观察、碳源反应及酶学反应由中国食品发酵工业研究院微生物检测中心完成。

1. 2. 4 16S rDNA和pheS基因序列测定、分析及系统发育树构建 16S rDNA和pheS基因序列测定、分析及系统发育进化树绘制由中国食品发酵工业研究院微生物检测中心完成；测序结果利用GenBank数据库进行BLAST同源序列检索，然后采用MEGA 5.0进行同源性分析，1000次相似度重复计算，构建以置信度为依据的系统发育进化树（王颜颜等，2017）。

1. 2. 5 涂布培养观察菌体数量动态 按照1.2.1进行茶叶籽水浆发酵，取0～20 h（每小时1次）发酵液中间液体10 mL，稀释10000倍，取0.2 mL稀释液用涂布法接种至MRS固体培养基上，然后于25 ℃恒温培养36 h，记录每个培养基上的菌落数，重复3次（辛若竹等，2008；金雷等，2014）。

2 结果与分析

2. 1 茶叶籽水浆发酵杆菌的分离与纯化结果

通過分离纯化培养，从茶叶籽水浆发酵液中分离出两株菌株，编号分别为JJZ12和JJZ21。在相同条件下，二者的菌落及培养基颜色存在差异，JJZ21的菌落表现为纯白色，JJZ12的菌落表现为淡红色（图1），用肉眼即可直接区分。

2. 2 JJZ12菌株的鉴定结果

2. 2. 1 JJZ12菌株的菌落特征及个体形态 由图2可看出，JJZ12菌株的菌落呈圆形，白色，凸起，表面光滑湿润，边缘整齐。25 ℃培养48 h的菌体形态如图3所示，菌体呈杆状，大小0.6～1.2 μm×1.0～3.0 μm，成对或短链排列，革兰氏阳性。

2. 2. 2 JJZ12菌株的生理生化特征 从表1可看出，JJZ12菌株对大多数D型糖类呈阳性，而对非糖类碳源大多呈阴性。对JJZ12菌株的酶学特征进行测试，结果表明，JJZ12菌株对氧化酶呈阴性、接触酶呈阳性。

2. 2. 3 JJZ12菌株的16S rDNA序列测定分析结果

由图4可看出，JJZ12菌株的16S rDNA序列全长1354 bp。利用BLAST进行序列同源检索，相似度在97%以上的葡萄糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter）有10种，其中与G. liquefaciens的相似度达100%。以16S rDNA序列的同源性为基础，用MEGA 5.0进行系统发育进化分析，结果如图5所示，系统发育进化树中G. liquefaciens IFO 12388T（X75617）是一个单独的外群种，JJZ12菌株与该种单独构成一个分支；二者序列的相似性最大，遗传距离最小，即JJZ12菌株与该种的亲缘关系最近。

综合上述形态观察、碳源反应、酶学反应、16S rDNA序列比对及系统发育进化树分析结果，JJZ12菌株被鉴定为产液葡糖酸醋杆菌（G. liquefaciens）；结合研究编号，JJZ12菌株命名为G. liquefaciens JJZ12（茶叶籽产液葡糖酸醋杆菌）。

2. 3 JJZ21菌株的鉴定结果

2. 3. 1 菌株JJZ21的菌落特征及个体形态 JJZ21菌株25 ℃培养48 h的菌落呈圆形，白色，凸起，表面光滑湿润，边缘整齐（图6）；菌落个体形态如图7所示，菌体呈杆状，大小0.5～0.7 μm×0.8～1.7 μm，单个或成对排列，革兰氏阳性。

2. 3. 2 JJZ21菌株的生理生化特征 由表2可看出， JJZ21菌株对大多数的芳胺酶及糖苷酶呈阴性，对大多数的D型糖类碳源呈阳性。

2. 3. 3 JJZ21菌株的16S rDNA及pheS基因序列测定分析结果 从图8可看出，JJZ21菌株的16S rDNA序列全长1417 bp，pheS基因序列全长410 bp。利用BLAST进行序列同源检索，相似度在98%以上的植物乳杆菌（Lactobacillus）近缘种有10种，其中与L. plantarum subsp. plantarum的相似度达100%。以16S rDNA及pheS基因序列的同源性为基础，用MEGA 5.0进行系统进化分析，可知系统发育进化树中L. plantarum subsp. plantarum ATCC 14917T（ACGZ01000098）是一个单独的外群种，JJZ21菌株与该种单独构成一个分支（图9）；二者序列的相似性最大，遗传距离最小，但可靠性只有66%，不足以给出结论；但从图10可看出，JJZ21菌株仍与L. plantarum subsp. plantarum相似性最大，遗传距离最小，且可靠性达100%；综合两种分析结果，可初步判定JJZ21菌株与L. plantarum subsp. plantarum的亲缘关系最近。

综合上述形态观察、碳源反应、酶学反应、16S rDNA及pheS基因序列比对及系统发育进化树分析结果，JJZ21菌株被鉴定为L. plantarum subsp. plantarum；结合本研究编号， JJZ21菌株命名为L. plantarum subsp. plantarum JJZ21；菌种保藏在中国典型培养物保藏中心（保藏号CCTCCM 2016471）。

2. 4 JJZ12和JJZ21杆菌在茶叶籽水浆发酵过程中的数量动态变化

为了确定JJZ12和JJZ21杆菌在茶叶籽水浆发酵中的作用，测定茶叶籽水浆发酵过程中不同时段发酵液中JJZ12和JJZ21的菌体总数量，结果如图11所示，JJZ12和JJZ21的菌体总数量在发酵前5 h增加缓慢，之后快速增加，发酵至15 h时，菌体总数量达最高点，之后逐渐回落进入稳定状态。

3 讨论

3. 1 JJZ12和JJZ21菌株的特征特性

G. liquefaciens JJZ12是产液葡糖酸醋杆菌（G. liquefaciens）的一个菌株；葡糖酸醋杆菌在分类地位上属于变形菌门（Proteobacteria）α-变形菌纲（Alphaproteo bacteria）红螺菌目（Rhodospirillales）醋酸菌科（Acetobacteraceae）葡糖酸醋杆菌属（Gluconacetobacter）的一个种（冯静等，2009）。产液葡糖酸醋杆菌属是红茶生产中的主要发酵微生物，目前已从红茶菌中分离得到了以产液葡糖酸醋杆菌为代表的8种葡糖酸醋杆菌（Brown et al.，1976；Fotan et al.，1991）。在红茶发酵过程中，产液葡糖酸醋杆菌必须与酵母菌共生，才能完成红茶的发酵作用（Iurkevich and Kutyshenko，2002）。由此推测，在茶叶籽水浆发酵过程中，G. liquefaciens JJZ12与茶叶籽酵母（Meyerozyma caribbica JJZ11）（姜金仲等，2017b）间的关系也可能是一种共生关系，二者合作完成茶叶籽水浆的初期发酵作用。同时，由于产液葡糖酸醋杆菌是红茶生产中常见的微生物，说明以其发酵生产的茶叶籽油、茶叶籽酵素及茶叶籽淀粉对人体健康安全。在进行两种杆菌分离培养时，JJZ12的菌落表现为淡红色，该红色可能是JJZ12的分泌物，因为JJZ12是产液葡糖酸醋杆菌的一个菌株，而产液葡糖酸醋杆菌是红茶主要发酵微生物之一，红茶的红色部分来自产液葡糖酸醋杆菌的发酵作用，故JJZ12也可能会使培养基表现出淡红色特征。

L. plantarum subsp. plantarum JJZ21是植物乳杆菌（L. plantarum subsp. plantarum）的一個菌株。植物乳杆菌由于其自身的益生特性及生物学特性，已广泛应用于酸奶、干酪、乳酸菌饮料及发酵干肠、泡菜、调味品等食品中。Erkkil?等（2001）应用植物乳杆菌发酵干肠，得到了新风味的干肠制品；周光燕等（2006）将植物乳杆菌接种到泡菜中进行发酵，结果发现植物乳杆菌可明显降低泡菜中的亚硝酸盐含量；郭翔等（2009）对植物乳杆菌作为益生菌的生物安全性进行研究，结果表明，植物乳杆菌对人体安全无害；Lee等（2010）以分离自泡菜中的植物乳杆菌生产酸奶，结果表明该酸奶具有较好的抑菌功效。综上所述，植物乳杆菌是一个具有广泛食品生产用途且无毒无害的发酵微生物，因此，利用L. plantarum subsp. plantarum JJZ21菌株发酵生产的茶叶籽油、茶叶籽酵素及茶叶籽淀粉对人体也安全。崔宪等（2016）进行了植物乳杆菌发酵处理大豆蛋白的研究，结果表明，与原始大豆蛋白和发酵0 h时提取的大豆蛋白相比，经发酵过的蛋白分子进一步展开，β-折叠含量升高，α-螺旋含量降低，荧光光谱中最大吸收波长发生红移，暴露巯基含量升高；扫描电子显微镜观察结果表明，大豆蛋白经发酵后表面不再光滑，出现腐蚀性孔洞。由此可预见，JJZ21植物乳杆菌在茶叶籽水浆发酵过程中也可能会对茶叶籽油脂体表面的蛋白质发生作用，从而促进或降低茶叶籽油脂体上浮或下沉（发酵分层现象），是一个值得进一步研究的问题。

上述有关产液葡糖酸醋杆菌及植物乳杆菌菌株的研究均是在无抗菌性的食品中进行；而JJZ12和JJZ21的研究是在含有大量茶皂素的茶叶籽水浆中进行，茶皂素具有很强的抑菌作用（江和源等，2007），但G. liquefaciens JJZ12和L. plantarum subsp. plantarum JJZ21仍能在高浓度的茶皂素溶液里安全快速繁殖生长，并完成发酵作用。这是JJZ12和JJZ21菌株与其他同类菌株（Gobbetti et al.，1994；Mohammadi-Gouraji et al.，2017）的最大差异，产生这种现象的原因有待进一步研究。

3. 2 JJZ12和JJZ21菌株的数量动态变化

茶叶籽水浆发酵初步分层出现在发酵5 h左右（姜金仲等，2017a）；JJZ12和JJZ21菌体总数量是在发酵5 h后才开始大量繁殖，说明JJZ12和JJZ21对茶叶籽水浆发酵分层现象发生的早期作用不明显。虽然茶叶籽水浆发酵分层最早发生在5 h左右，但此时的顶层非常软散，不能进行茶叶籽油生产操作，一般需等到发酵16 h时才是最佳操作点（姜金仲等，2017a）；而JJZ12和JJZ21菌株是在5 h后才进行大量繁殖，故发酵进行到5 h后，起主要发酵作用的微生物是JJZ12和JJZ21菌株，即JJZ12和JJZ21菌株是在茶叶籽水浆发酵中后期起主要作用的微生物。

刘英男等（2007）研究了植物乳杆菌AR326的生长曲线，结果表明，培养5 h后该菌株进入对数生长期，16 h后达到最高点。张峥等（2017）研究了植物乳杆菌LP-2的生长曲线，认为发酵5 h后进入对数期，至15 h后达到最高点，JJZ21和JJZ12菌株的数量动态变化与刘英男等（2007）、张峥等（2017）的研究结果基本一致。

4 结论

JJZ12和JJZ21两株杆菌是茶叶籽水浆发酵中后期起主要作用的发酵微生物，该结论为解释茶叶籽水浆发酵分层现象的发生机理提供了理论依据。

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（責任编辑 罗 丽）