李玉波 马雪玲 李志更 贾海骅 梁媛 郝改梅
摘要 目的:观察保和丸对高脂饮食SD大鼠血脂和肠道菌群的影响,为临床应用和实验研究提供参考依据。方法:将60只大鼠随机分为4组:正常组、模型组、高脂饮食保和丸组(简称“高保组”)、正常饮食保和丸组(简称“正保组”),Elisa法检测大鼠血清血脂含量,基于16SrDNA基因测序技术分析大鼠肠道菌群。结果:高保组大鼠血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)含量与模型组比较明显减少但仍高于正常组和正保组,正保组与正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。肠道菌群分析结果显示正保组与正常组大鼠比较,其粪便样本微生物菌群数量无明显差异。高保组与模型组比较能显著增加纲双歧杆菌目、梭菌目、脱硫弧菌目、产氢细菌目菌群数量,但仍低于正常组和正保组;同时能显著减少红蝽菌目、拟杆菌目、芽孢肝菌目、乳杆菌目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目、气单胞菌目、疣微菌目菌群数量,但仍高于正常组和正保组。结论:保和丸可能通过改变肠道菌群多样性来降低TC、TG和LDL-C。
关键词 肠道菌群;保和丸;高脂饮食;血脂
Abstract Objective:To observe the effects of Baohe Pills on blood lipid and intestinal microbiota in SD rats with a high-fat diet to provide reference for clinical application and experimental research.Methods:A total of 60 rats were randomly divided into 4 groups:normal group,model group,high-fat diet with Baohe pills group (HB group) and the normal diet with Baohe pills group (NB group).The serum lipid level was detected by Elisa method,and the intestinal microbiota of rats was analyzed based on 16S rDNA gene sequencing technique.Results:the contents of serum cholesterol (TC),triglyceride (TG) and low-density lipoprotein (LDL-C) in the rats of HB group were decreased more significantly than those of the model group,but less than those of the normal group and the NB group.There was no statistically significant difference between the normal group and the NB group.The results of intestinal microbiota analysis showed no significant difference in number of fecal microbial flora between the NB group and the normal group.Compared with the model group,the numbers of Bifidobacteriales,Clostridiales,Desulfovibrionales,and RF9 bacteria of HB group decreased more than that of the normal group and the NB group.In the meantime,compared to the model group,the HB group experienced a significantly reduction in the number of Coriobacteriales,Bacteroidales,Bacillales,Lactobacillales,Erysipelotrichales,Burkholderiales,Aeromonadales,Verrucomicrobiales,etc.,but the number was still higher than that of the normal group and the NB group.Conclusion:Baohe pills may reduce TC,TG and LDL-C by altering the diversity of intestinal microbiota.
Key Words Intestinal microbiota; Baohe Pills; High-fat diet; Blood lipid
中圖分类号:R285.5文献标识码:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.003
当前诸多研究显示,长时间的高脂饮食可以长期而持续的改变肠道微生态[1-3],肠道菌群失调可以引起脂代谢紊乱,导致高脂血症[4-8]。而保和丸为消食剂,具有消食、导滞、和胃之功效,临床上具有降低血脂的作用[9-11]。本研究采用高脂饮食长期喂养SD大鼠,观察保和丸对其血脂和肠道菌群的影响,探讨保和丸消食作用的现代生物学内涵。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 雄性SD大鼠60只,SPF级,6周龄,体重范围(250±10)g,购自北京维通利华生物技术有限公司,按照随机数字表法将60只大鼠分成4组,即模型组、正常组、高脂饮食保和丸组(简称“高保组”)、正常饮食保和丸组(简称“正保组”),每组15只,饲养高保组和模型组小鼠所需的高脂饲料也购买自北京维通利华生物技术有限公司。本研究经过中国中医科学院中医基础理论研究所动物实验伦理审查委员会的许可。
1.1.2 药物 保和丸(水丸)(北京同仁堂科技发展股份有限公司,国药准字Z11020921),用法用量:1次1袋,2次/d。人(70 kg)与大鼠(0.2 kg)间药量折算系数为6.3,若70 kg成人1次的用药剂量为6 g,则转化为0.25 kg大鼠1次的用药量为0.135 g。将6 g保和丸溶于22 mL生理盐水,得到0.27 g/mL的保和丸溶液,给药体积为0.5 mL。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 高保组高脂饲料饲养,正保组普通饲料饲养,每组每只每日灌胃0.5 mL保和丸溶液2次,早8:00和晚20:00各1次;模型组大鼠高脂饲料饲养,正常组大鼠普通饲料饲养,每组每只每日灌胃0.5 mL生理盐水2次,早8:00和晚20:00各1次。
1.2.2 收集样本(粪便和血清) 实验7周后取材,取材前1天7:00—23:00,间隔8 h收集4组大鼠的新鲜正常粪便,每次每组收集10个大小、质地相同的粪便,总共收集到120个样本。取材当天用10%水合氯醛麻醉大鼠(根据每只大鼠的体重计算水合氯醛的使用量),用一次性灭菌注射器腹主动脉取血2~3 mL,置于黄色采血管中离心,抽取血清,共计40个样本。所有样本均保存于-80 ℃恒温冰箱。
1.2.3 粪便样本DNA提取和PCR扩增 DNA快速提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司,解冻粪便样本后提取细菌DNA,吸取5 μL,通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳测定DNA浓度、分析DNA质量和数量。
PCR扩增的范围为16SrDNA V3~V4可变区,引物由北京奥维森基因科技有限公司合成,序列为5′-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′/5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′。每个样本3个重复,2%琼脂糖凝胶电泳检测同一样本的PCR混合产物,AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(购自AXYGEN公司)回收PCR产物。
1.2.4 荧光定量、Miseq文库构建和上机测序 此步骤由北京奥维森基因科技有限公司完成。
1.2.5 Elisa法检测4组大鼠血脂水平 大鼠血脂4项指标具体为:血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C),Elisa试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
1.3 统计学方法 采用随机区组方差分析大鼠血脂水平。采用R语言工具、抽平分析、秩和检验和Anosim相似性分析肠道细菌群落。
2 结果
2.1 4组大鼠饲养7周后血脂水平 模型组大鼠TC、TG、LDL-C含量明显高于正常组,HDL-C含量明显低于正常组。正保组大鼠TC、TG、LDL-C含量与正常组比较略有减少,HDL-C含量略有增加,差异无统计学意义(P>0.05)。高保组TC、TG、LDL-C含量与模型组比较明显减少但仍高于正常组且差异有统计学意义(P<0.05),HDL-C含量与模型组比较略有增加但差异无统计学意义(P>0.05),但仍低于正常组且差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2 肠道菌群多样性分析
2.2.1 OTU分布 利用R语言工具统计分析(选用相似水平为97%)多个样本中所共有和独有的OTU数目,并绘制Venn图。
2.2.2 Alpha多样性指数 抽平分析最低序列数的样本数,4组大鼠肠道菌群多样性指数。见表2。模型组肠道菌群多样性明显少于正常组,正保组与正常组肠道菌群数量比较,差异无统计学意义(P>0.05),高保组肠道菌群多样性明显多于模型组,但仍略低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2.3 Anosim相似性分析结果 4组大鼠肠道菌群比较,组间差异有统计学意义(两两比较R值均大于0),正常组与正保组大鼠肠道菌群比较,差异无统计学意义(P>0.05),其余组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。
2.2.4 群落结构分析 经过Anosim相似性分析,将4组大鼠粪便样本中存在差异的菌群进行了聚类,模型组菌群数量主要集中在放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门等,与正常组比较存在显著性差异,其中双歧杆菌目、梭菌目、脱硫弧菌目、产氢细菌目菌群数量模型组明显减少,其余明显增加。正保组与正常组大鼠比较,其粪便样本微生物菌群数量无明显差异。高保组与正常组、正保组、模型组比较,粪便样本微生物菌群数量差异有统计学意义。高保组与模型组比较能显著增加纲双歧杆菌目、梭菌目、脱硫弧菌目、产氫细菌目菌群数量,但仍低于正常组和正保组;同时能显著减少红蝽菌目、拟杆菌目、芽孢肝菌目、乳杆菌目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目、气单胞菌目、疣微菌目菌群数量,但仍高于正保组和正常组。具体如表4、图2所示。
3 讨论
从4组大鼠饲养7周后血清血脂含量来看,高保组能明显降低TC、TG、LDL-C含量,说明保和丸具有一定的降低血脂的作用。中医学脏象理论中的“脾”的内涵与现代医学所指的消化系统相似,而肠道菌群在消化过程中发挥着重要的作用,本研究表明保和丸对高脂饮食大鼠的肠道菌群有明显的改变,这或许是保和丸降低血脂的作用机制之一。
大多数中医学者认为痰浊、瘀血为血脂异常的主要致病因素[12]。《临证指南医案》曰:“湿为重浊有质之邪,若从外而受者,皆由地中之气升腾;从内而升者,皆由脾阳之不足。亦有外不受湿,而但从内生者,必其人膏粱酒醴过度,或嗜饮茶汤太多,或食生冷瓜果及甜腻之物”。又《世补斋医书》云:“自逸病之不讲,而世但知有劳病,不知有逸病。然而逸之为病,正不小也……安逸所生病与劳相反……夫逸之病,脾病也”。可见过逸少劳可致脾气虚弱,水谷精微化生乏力,清浊混淆而发为高脂血症。保和丸是消食剂的代表方,方中山楂消油腻肉积;神曲消酒食陈腐之积;莱菔子消面食痰浊之积;陈皮、半夏、茯苓理气和胃,燥湿化痰;连翘散结清热;诸药合用,有消食导滞,理气和胃之功。
人类的肠道菌群丰富度超过3 500种[15],其中厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门占了95%以上[16]。
许多循证医学研究指出:高脂血症患者肠道菌群失衡,主要表现为双歧杆菌等益生菌菌群数量减少,而大肠杆菌、幽门杆菌等菌群数量明显增加[17-20]。本研究从肠道菌群分析结果来看,保和丸能促进双歧杆菌目菌群数量,与文献报道一致。同时保和丸还能促进梭菌目、脱硫弧菌目、产氢细菌目菌群数量,减少红蝽菌目、拟杆菌目、芽孢肝菌目、乳杆菌目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目、气单胞菌目、疣微菌目菌群数量。
生物与环境的统一论是微生态学的基本观点,这与中医学基本观点整体观具有统一性,机体内的微生态系统,是正常微生物群与宿主和环境相互依赖、相互作用的统一有机整体[21]。具体而言,微生态学与中医学都讲究平衡与调节,微生态学有平衡理论对应中医学有阴阳五行学说、微生态学有微生态调节论对应中医学有扶正祛邪理论[22],因此,肠道微生态原理可以成为中西医结合的一个切入点。本研究结果显示中医经典古方保和丸具有一定的降低血脂的作用,并且一直以来临床上无不良反应报道,因此在临床降脂用药方面,保和丸的应用或许能一定程度的减少他汀类等降脂化学药物的使用从而减少他汀类药物的不良反应。
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(2018-06-04收稿 责任编辑:张文婷)