紫外分光光度法检测豆腐渣中植物雌激素的含量

孙勇　王丰玮　徐晓燕

[摘要]本研究主要对检测豆腐渣中植物雌激素含量的方法展开研究，然后通过实验研究的方式探讨紫外分光光度法的具体应用。选取染料木素作为研究的标准品，应用紫外分光光度计对豆腐渣中的植物雌激素含量进行检测。紫外分光光度法是一种基于物质分子对不同波段光辐射吸收存在着较大差异而建立的方法。通过大量的实践研究证明，该方法用于物质含量的测定有着较大的优势，不仅操作较为简便，而且具有较高的准确度，因此该方法被广泛应用于保健品的检验之中。本研究将该方法应用到豆腐渣中植物雌激素的含量测量上，也同样取得了较好的效果。

[关键词]植物雌激素；检测方法；豆腐渣；含量

中图分类号：TS207.3 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180410

随着人们生活水平的不断提高，如何获得健康越来越成为人们关注的话题。在现在快节奏、压力大的生活环境下，人们自身的免疫力逐渐下降，癌症和心脑血管等疾病的发病率逐步提高，更需要营养来维持机能、保护健康，植物雌激素就是一个很好的选择。

豆科植物在成长过程中会形成一定含量的植物雌激素，该物质属于豆科植物产生的二级代谢物。从众多关于该物质的研究中表明，大豆植物雌激素对人体生理有着积极作用，长期食用可有效降低许多疾病的发生率，如妇女更年期综合征、高血脂、乳腺癌、骨质疏松、前列腺疾病等，同时在抗癌方面也展现出较好的效果。

1植物雌激素的相关性质

1.1植物雌激素的概念

植物中具有弱雌激素作用的化合物是植物雌激素，其弱雌激素效应是经过与甾体雌性激素受体以低亲和度结合而发挥的。植物雌激素是一种具有和动物雌性激素生物活性相似的植物成分，它们对激素水平不稳定引起的一系列疾病有着很大的作用力，特别是对防治乳腺疾病、绝经期出现的很多综合征、前列腺疾病、骨质疏松和心脑血管疾病非常有效。尽管被广泛称为植物雌激素，但其实它们本身并不是激素，异黄酮的活性结构和成分，其结构类型与女性体内所需要的雌性激素非常相似，可以起到选择干扰、选择模拟、双向调节内分泌水平的生理作用，给广大女性远离烦恼、追求健康带来了新的曙光。从植物尤其是豆科类植物中提取的植物雌激素可以替代雌激素，并且还可以防止雌激素发生不良反应。

传统中医也认为，大豆等植物所具有的营养成分，在临床上经常用来降血糖、降脂肪、降血压以及预防心脑血管疾病、动脉粥样硬化等疾病，这是由于植物雌激素可以保护血管的弹性，降低心脑血管疾病的发生率。长期使用雌激素能针对多种生命器官产生“雌激素样作用”，产生作用的部位包括女性乳房和卵巢。与药物雌激素相比，紫花苜蓿、坚果、谷物大豆中的植物雌激素食用起来既方便又安全。

1.2植物雌激素的化学结构

异黄酮、二苯乙烯和木酚素是天然存在于植物中的成分，显示出一定的雌激素活性，但其生物活性相对较弱，与哺乳动物雌激素17β-雌二醇的结构相似，主要是与雌二醇的特征更为相似，其中包括一对羟基和苯酚环，对雌激素受体吸附后者起着决定性的作用。然而，不同的植物雌激素结构存在的一些细小差异可能会极大地改变雌激素活性。植物雌激素的结构式见图1。

1.3植物雌激素的特点

1.3.1双向调节作用

植物雌激素的结构类似物与雌激素活性有关，表现出协同抑制植物雌激素。双向调节作用是指当人体内雌激素水平过低时，植物雌激素占据雌激素受体，发挥弱雌激素的效应，表现出体内雌激素水平升高；当人体内雌激素水平过高时，植物雌激素受体占据“竞争”的地位，同时发挥弱雌激素效应，因此一般表现出较低的雌激素水平。

1.3.2具有选择性

和植物雌激素亲和力很强的是膀胱、前列腺、心脑血管这些受体，但和卵巢、骨组织、乳房、子宫等的亲和力比较弱，其活性仅为雌性激素的1N99～1/999 99。植物雌激素能选择性地与雌激素结合，减少雌激素诱发癌症的概率。

1.4不同加工方法对植物雌激素含量的影响

各种豆制品的植物雌激素种类和含量分布是不同的，不仅与种植环境和品种有关，还与加工过程紧密相连。热处理、水处理、凝固等加工工艺过程和方法对大豆制品中的植物雌激素含量和物种分布也是有影响的，特别是大豆分離蛋白和大豆浓缩蛋白的不同制取方法对植物雌激素含量的影响是最大的。

1.4.1热处理

植物雌激素遇到过热的水会增加向外的渗透速度，热水的渗透使大量的植物雌激素减少，同时大豆制品中的植物物种分布由于热处理会发生改变，因为酶的活性在热处理时会不断升高，把植物雌激素糖苷水解为自由型植物雌激素，所以自由型植物雌激素的比重在大豆制品中会逐渐增加。

1.4.2水处理

浸泡会使植物雌激素的9%丢失在水中，而且经过水处理后的大豆中植物雌激素游离型有所增加。

1.4.3发酵工艺

发酵会改变植物雌激素的物种分布，但并不影响植物雌激素的含量，发酵后产品的主要存在形式是自由型植物雌激素，这是由于在发酵的过程中，水解酶产生的大量菌水解了雌激素糖苷，从而自由型的植物雌激素就会有所增加。

1.4.4凝固工艺

在豆腐渣的凝固过程中，植物雌激素会因为凝固损失于乳清中，损失率为39%。

1.4.5加工提取方法

大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白含量由于提取植物雌激素的方法也会有所影响。可溶性碳水化合物如果用湿热水洗法洗涤得到浓缩蛋白的植物雌激素含量与原料大豆中的含量非常接近，但是大豆浓缩蛋白的植物雌激素用55%～60%的乙醇溶液洗涤，提取得到的只为原料中的1/9。

1.5植物雌激素的作用

1.5.1改善肤质，缓解更年期不适

植物雌激素的类雌激素样作用可使人皮肤细腻、润滑、不松弛且富有弹性；提亮肤色，使黑色素不沉着，肤色均匀；雌激素水平可以得到调节，更年期的症状会有所缓解。

1.5.2改善经期紊乱

月经期间不舒服是雌激素分泌不足引起的，植物雌激素的双向调节作用可以使雌激素水平恢复正常，改善经期不适的情况。

1.5.3延缓衰老

植物雌激素可以推迟更年期的到来，减缓女性卵巢功能衰退的速度。

1.5.4预防心脑血管疾病

植物雌激素可以预防心脑血管疾病，防止动脉粥样硬化疾病的发生。

1.5.5防治骨质疏松症

植物雌激素可以维持人体雌激素的分泌水平，及时为人体补充植物雌激素，有效预防骨质疏松。

1.5.6预防乳腺癌

雌激素的双向调节可减少女性由于雌激素的水平过高而患乳腺癌的概率。

1.5.7改善产后精神障碍

妇女分娩后雌激素水平过低，还未得到恢复，容易形成精神障碍，从而导致植物神经紊乱，及时补充植物雌激素可以有效改善产后精神障碍。

1.6植物雌激素的前景与展望

由于植物雌激素有明显的生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、保护血管、改善骨质疏、抗炎等，在社会上和学术界开始受到越来越多的重视，成为近年来科学家研究的重点。随着人民生活水平的不断提高，健康越来越成为人们重视的问题，大豆植物雌激素具有广阔的前景。美国首先发现了植物雌激素的生理特点，指出大豆物质中的最具有药用价值的活性成分就是植物雌激素。1999年许多著名专家对于天然活性物质具有抗癌作用展开了会议，肯定了大豆植物的雌激素是有效的抗癌活性物质，同时指出了植物雌激素具有以下生理特点：（1）是保健品和药品昂贵的添加剂和配料，可以防治肺癌、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌的发生；（2）可以防治与抑制白血病、骨质增生和心血管疾病，具有抗溶血活性和抗真菌活性。因此，在保健食品和医药领域植物雌激素将会有广阔的应用前景。

但是再好的东西也只能适量补充，植物雌激素也有它不利的一面，高剂量的雌激素对生长发育有不利影响，它会改变女性的月经周期。因此，我们应该更加深入地研究，通过进行更多的实验，使植物雌激素更加科学合理地被开发和被利用。

2豆腐渣的介绍

2.1豆腐渣的來源

豆腐是最常见的豆制品，又称水豆腐，主要的生产过程是制浆和凝固成形。制浆即将大豆制成豆浆；凝固成形即豆浆在热量与凝固剂的共同作用下凝固成含有大量水分的凝胶体。豆腐渣是豆腐加工的副产品，是在制豆腐时滤去浆汁后所剩下的渣滓，含有较丰富的营养物质，其粗蛋白含量可达25%～30%，是膳食纤维中最好的纤维素，被称为“大豆纤维”。

2.2豆腐渣对人的益处

大豆的植物雌激素含量非常高，而作为大豆制品的豆腐渣，其植物雌激素含量也不低。豆腐渣营养非常丰富，含有多种人体不可或缺的铁、钙、镁等微量元素，同时富含优质蛋白、糖和植物油，素有“植物肉”的美誉，对人的益处特别多。

2.2.1消油降脂

含有食物纤维的豆腐渣可以吸附胆固醇，从而防止吸收多余的胆固醇，有效降低血液中胆固醇的含量，防止增加血液黏度，预防动脉粥样硬化、高血压、中风等疾病的发生。

2.2.2治疗便秘

大量食物纤维存在于豆腐渣中，经常吃豆腐渣能增加粪便的体积，有利于体内毒素的排出，可以促进肠道的蠕动，使大便变软，有利于排出大便，防止出现便秘等一系列肛肠问题。补益清热的健康食品第一位当属豆腐渣，常食用豆腐渣可清热润燥、补气、清理肠胃、生津止渴，热性体质更适合食用豆腐渣，可用于调理口臭、肠胃不清，有助于患者发热后的恢复。

2.2.3减肥消脂

豆腐渣的特点是高蛋白质、低热量、高膳食纤维、低脂肪，人吃过之后能够增加饱腹感，而且热量低于其他食物，因此非常适用于减肥人群。

2.2.4降血糖

豆腐渣除了含有膳食纤维，还含有不饱和脂肪酸、粗蛋白，这些物质有助于延缓糖分在肠道的被吸收能力，降低就餐后血糖上升的速度，使糖尿病患者的血糖得到有效的控制。

2.2.5抑制癌症

豆腐渣中含有抑制癌症的有效成分如豆甾醇、甾固醇，经常食用豆腐渣，能够大大降低结肠癌、胰腺癌的发病率。

2.2.6预防骨质疏松症

医学家证明，豆腐渣除了有帮助人体消化、增加营养吸收、调节消化不良的功能外，对骨骼、牙齿的生长发育也大有益处，还可以增加造血时血液中的铁含量。豆腐渣中含有大量的钙元素，易消化吸收，吸收和消化率高达90%以上，常吃豆腐渣有利于老年人预防骨质疏松症。

3植物雌激素含量测定的方法

测定植物雌激素含量的方法有很多种，如紫外分光光度法、高效液相色谱串联质谱法、毛细管电泳法、薄层扫描色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。

3.1紫外分光光度法

紫外分光光度法是基于物质分子对200～400nm光辐射的吸收而建立起来的方法。由于200～400nm光辐射的能量主要适用于物质中原子价电子的能级跃迁，可以导致这些电子的跃迁。该方法简便、准确、重现性好，适用于保健品的日常分析植物雌激素的含量。

3.2高效液相色谱串联质谱法

在植物雌激素被高效液相色谱串联质谱法检测时，如果色谱图中每个峰用标准样品定性方法确定，因为有许多类型的植物雌激素，所以标准样品的需求各种各样。植物雌激素标准样品是特别昂贵的，目前丙二酰和乙酰形式异黄酮标准样品尚无任何供应厂商，合成标准样品或自行分离的方法非常麻烦，不提倡使用。若检测使用植物雌激素水解为苷元，如果水解加入氯离子会使色谱柱的使用寿命大大缩短，从而使用高效液相色谱法定性和定量分析植物雌激素有很多不方便。用高效液相色谱串联质谱法联用技术检测植物雌激素，解决了定性由于缺乏标准样品的分析问题，能快速准确地确定色谱峰在色谱图的归属。因为丙二酰和乙酰形式异黄酮的异黄酮糖苷和摩尔消光系数相同，根据异黄酮糖苷标准样品来计算响应因子的含量，所以只需要3种异黄酮糖苷标准品，便可用于定量分析所有的植物雌激素，植物雌激素的定性和定量分析因此也很方便。

3.3毛细管电泳法

毛细管电泳法的优点是采样高、速度快、分离效率高，处理起样品来非常经济简便，此方法渐渐成为植物雌激素含量的重要测定方法之一。

3.4薄层扫描色谱法

薄层扫描色谱法的优点是分离效果好、取样量少、操作简单，但是人为操作误差大，而且显色剂薄层用量难以精确控制，定量准确度低，分离效果不高，所以不提倡使用。

3.5气相色谱法

气相色谱法的优点是敏感性高、进样量少、特异性强、选择性高，但是需制备衍生物来测定金雀异黄素和大豆黄素，制备样品过程复杂，易受杂质的干扰，价格昂贵且耗时比较久，因此该方法的普及受到了限制。

3.6高效液相色谱法

高效液相色谱法是目前在植物雌激素的研究最广泛的测定方法之一，用不同浓度的甲醇、乙醇提取样品，超声回流提取直接用酸或酶水解后测定。该方法的特点是分离效率高、样品的测定方法广、样品制备过程简单、成本低廉、灵敏度高、测量结果的准确性好等，有多样选择的检测器。该方法和紫外分光光度法一样也适用于保健品的日常分析和质量控制，但高效液相色谱法测试时间太长，运行成本又过高，特别是豆腐渣中植物雌激素的含量需要被反复检查、探索和提取，不利于大规模生产和操作。

此外，在医学上对植物雌激素的含量进行测定还有酶联免疫吸附法和时间分辨荧光免疫法，这些方法在对植物雌激素的测定方面可以达到一个很好的效果，其他方便快速的分析方法需要更进一步的研究和使用。

通过以上对比，本研究采用紫外分光光度法分析测定豆腐渣中植物雌激素含量。

4实验部分

4.1实验仪器与试剂

4.1.1仪器

紫外可见分光光度计、超声波清洗机、电热恒温水浴锅、旋转蒸发器、电子分析天平、冷却装置、粉碎机、烘箱、10目标准筛。

4.1.2试剂

新鲜豆腐渣（现场制作）、石油醚（沸程55℃～85℃）、染料木素标准品、95%乙醇溶液。

4.2实验方法

4.2.1标准溶液的配制

准确称取染料木素标准品1.29mg，置于10mL容量瓶中，以95%乙醇稀释搅拌至溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀静置，浓度为129mg/L。

4.2.2样品溶液的制备

现场制作的豆腐渣在55℃鼓风机条件下鼓风干燥72h平行至恒重，过10目筛，用石油醚脱脂48h，去除其滤液，烘干滤渣，采用超声波法提取豆腐渣中植物雌激素。称取已处理豆腐渣粉4.5g，溶于35mL80%的乙醇溶液中，超声波提取的温度为55℃，提取时间为0.5h，然后将其提取液过滤，置于50mL容量瓶中，用95%乙醇溶液定容至刻度静置。

4.2.3波长的选择

分别取适量配置好的标准溶液和样品溶液，用95%乙醇溶液稀释至合适的浓度，用95%乙醇溶液做空白试验，在紫外区波长为200～400nm进行扫描，采样的间隔为1nm，匀速采樣，根据紫外吸收光谱图确定样品的测定波长。染料木素标准溶液在不同波长时的吸光度见表1，豆腐渣待测样品液在不同波长时的吸光度见表2。

4.2.4标准曲线的绘制

准确吸取0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL的标准溶液分别置于10mL的容量瓶中，各加2.0mL的95%乙醇溶液，再加蒸馏水定容至刻度，摇匀静置。用2.0mL的95%乙醇溶液加蒸馏水定容至10mL的溶液做空白试验，在260nm处测量溶液的吸光度，重复3次，测定结果取其平均值。染料木素标准溶液紫外吸收光谱见图2。

4.2.5豆腐渣样品中植物雌激素的测定

准确移取1.0mL待测样品溶液，置于10mL的容量瓶中，加2.0mL的95%乙醇，蒸馏水定容至刻度。在260nto处测量定容后溶液的吸光度，重复3次，测定结果取平均值。根据标准曲线的回归方程，计算出植物雌激素的含量。豆腐渣待测样品液紫外吸收光谱见图3。

4.3结果与分析

4.3.1检测波长的确定

从200～400nm扫描的紫外吸收光谱图可以看出，染料木素标准品溶液在260nm处有最大紫外吸收峰，样品液在258nm处有最大紫外吸收峰，二者的最大紫外吸收波长大体一致。由于定量分析建立在染料木素标准品溶液的基础上，故取260nm作为紫外检测波长。

4.3.2标准曲线的绘制

以染料木素浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线，标准曲线见图4。用最小二乘法进行线性回归，得回归方程为C=8.063 4A-0.052 9，R²=0.999 3。

4.3.3精密度试验

精密吸取0.5mL标准溶液于10mL容量瓶中，加入1.0mL的95%乙醇溶液，蒸馏水定容至刻度摇匀静置。分别取6份定容后的溶液加至石英比色皿中的3/5处，连续在260nm处测量其吸光度，计算吸光度的相对标准偏差和标准偏差。以吸光度为纵坐标，测定次数为横坐标绘制曲线，标准曲线见图5。在线性范围内，6次测量结果的平均吸光度为0.807 9，标准偏差为0.002 1，相对标准偏差为0.27%。由于上述误差在可以接受的范围内，说明试验的重现性较好，紫外分光光度法测定豆腐渣提取物中植物雌激素具有良好的精密度。

4.3.4重复性试验

精密吸取0.5mL样品溶液6份，置于6个10mL容量瓶中，各加1.0mL的95%乙醇溶液，蒸馏水定容至刻度并摇匀静置。在260nm处测量其吸光度，以吸光度为纵坐标，测定次数为横坐标绘制标准曲线，标准曲线见图6。计算相对标准偏差。在线性范围内，6次测量的平均吸光度为0.962 6，标准偏差为0.003 4，相对标准偏差0.35%，试验的重现性较好。

4.3.5稳定性试验

精密吸取0.5mL新鲜配制的标准溶液和待测样品溶液各6份，置于12个10mL容量瓶中，各加1.0mL的95%乙醇，蒸馏水定容至刻度。分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h在260nm处测量溶液的吸光度，确定其稳定性结果，以吸光度为纵坐标，测定次数为横坐标绘制标准曲线，标准曲线见图7。标准溶液6次测量结果的平均吸光度为0.802 2，标准偏差为0.007 6，相对标准偏差为0.95%；样品溶液6次测量结果的平均吸光度为0.962 1，标准偏差为0.002 8，相对标准偏差为0.29%；表明標准溶液和样品溶液在24h之内是稳定的，所以24h之内测定提取液的吸光度是可行的。

4.3.6加样回收率试验

精密吸取O.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL标准品溶液，分别置于10mL容量瓶中，各加1.0mL的95%乙醇溶液，再分别加入1.0mL样品溶液，蒸馏水定容至刻度摇匀静置。将配好的5份溶液分别在260nm下测量吸光度，计算回收率，加样回收率的测定结果见表3。回收率平均值为100.23%，相对标准偏差为0.85%，表明此方法的回收率良好。

4.4实验结果

本研究建立了一种采用紫外分光光度测定豆腐渣中植物雌激素含量的方法。以染料木素为标准品，在其最大吸收峰260nm处测定豆腐渣中植物雌激素的含量，得回归方程为C=8.063 4A-0.052 9，R²=0.999 3，线性范围1.32～11.80μg/mL，平均回收率达100.23%，相对标准偏差为0.85%。

5结论

5.1紫外分光光度法的主要特点

5.1.1灵敏度高、选择性好

由于分光光度法的入射光以棱镜或光栅为单色器，同时在狭缝的控制配合下可得一条谱带很窄的单色光，因此其测定的灵敏度、选择性和准确度均比比色法高。紫外分光光度法可测定微量标准物质，测定灵敏度可达1～10μg/m，光度计定量测定的精密度可达0.5%，甚至可以更低。

5.1.2不需要样品分离装置

由于分光光度法使用的是纯度较高的单色光，因此利用此方法测定含有两种或两种以上样品组分时，不必先进行样品分离处理，只需选用样品组分特征波长的单色光就可进行测定分析。

5.1.3有多种定量方法

分光光度法不仅可采用线性回归方式进行定量，而且可直接通过百分消光系数与摩尔消光系数换算公式进行定量，因而在定量方式上较比色法更具有实效性。

5.2植物雌激素相关研究

中国食品和药物监测局已公开确认长期食用大豆产品对心血管系统具有保护作用，引起了学术界对植物雌激素的广泛关注。但仍有许多问题需要解决，如不同植物雌激素的生物活性化合物的差异。在研究人类健康和植物雌激素的关系时，细胞分子水平与大规模的流行病学调查结果的预防和治疗作用是不一致的，植物雌激素实验剂量往往比食物中植物雌激素的含量要多得多，并且使用纯度、剂量、类别和其他实验条件都均不相同，评价的标准缺乏一致性，对研究工作和植物雌激素的广泛应用增加了一定的难度。但是，随着植物雌激素在维持人体健康中发挥着越来越明显的作用，并具有其他很多雌激素不可替代的许多好处，植物雌激素的应用将会越来越广泛。

任何事物都有两面性，植物雌激素也不例外。虽然豆制品一般被认为是抑制癌症、降低有害胆固醇的好东西，从大豆中提取的植物雌激素也被广泛用于治疗女性更年期综合征，但是最近有科研小组发现，在一些情况下，豆制品也是有害的，甚至还有可能致癌。实验显示，体细胞有丝分裂过程由于植物雌激素受到了严重影响，这表明大豆植物雌激素及其消化和分解物质存在致癌的风险，还需要通过动物实验进一步证明其是否会严重影响身体的组织和器官，专家建议消费者应适当服用含有浓缩植物雌激素的药物。