采用微生物发酵法提取大豆油脂的发酵条件优化探究

王松霞

[摘要]目前提取大豆作物中的油脂可采用微生物发酵法，结合单因素实验，再配合响应曲面分析法实现对微生物的深度发酵，最终明确大豆油脂提取中所存在的诸多影响因素。本研究主要结合大豆油脂的微生物发酵实验方法对其发酵条件进行优化，分析该实验方法的具体流程及各因素对大豆油脂提油量的影响，最后得出实验结论。

[关键词]大豆油脂；微生物发酵法；条件优化；提油量影响

中图分类号：TS22 文献标识码：A DOI：10.16465/.j.gste.cn431252ts.20180816

大豆油脂取自大豆种子，可生产制作营养价值较高的优良食用油。大豆油中含有大量的棕榈酸、硬脂酸、花生酸、亚麻油酸、脂肪酸等，可显著降低血清胆固醇含量，起到预防心血管疾病的良好功效，同时大豆油脂在医用、工业生产中也有良好的应用。采用传统大豆油制油方法产油率偏高且加工过程简易，但大豆本身的营养价值容易遭到破坏，而且油脂在提取后所剩余的大豆粕被用作饲料，其潜在价值并未被完整发掘和充分利用。为此需要研究新方法来提高对大豆榨油后剩余料的有效利用，本研究对此提出了微生物发酵方法。

1大豆油脂采用微生物发酵的基本概述

目前基于大豆油脂的微生物发酵方法可实现大规模发酵产品技术优化，其主要发酵流程包含了对菌种的选育、对培育基的配制、对培养及接种产品分离的有效提纯等技术过程，提取大豆中的大豆油脂和大豆蛋白两种主要成分。所以可采用产酶菌种配合发酵过程中产生的大豆中种类丰富的酶，利用微生物发酵技术分离其中的大豆油脂与大豆蛋白，最后利用微生物发酵方法提取大豆油。该方法成本低廉、工艺简单、条件温和且营养价值损失偏小，在具体的发酵过程中，主要结合菌种生长与产酶实现同步操作，专门制取大豆油的不饱和脂肪酸和亚油酸等有益成分，同时确保发酵后的食用油品质符合国家标准。

针对大豆粕的处理方法则是在提油之后再进行简单处理，可获得质量较高且富含小肽的大豆蛋白副产品。在本研究中则主要采用微生物发酵方法，该方法可提取大豆油发酵过程中所产生的底物与原料破碎残渣，并对大豆油的初始pH值、发酵温度、发酵时间等进行分析，同时考察其对提油量的影响。在该过程中还采用响应曲面分析方法，结合提油量作为响应值，分析影响微生物提油的若干因素并进行相应优化，为微生物发酵提取大豆油脂创造有效的工艺环境条件。

2材料与方法

2.1材料与仪器

在开展大豆油脂的微生物发酵实验之前要合理选择材料和仪器。采用东北大豆配合万能粉碎机进行粉碎，获得豆粉，同时要用到枯草芽孢杆菌、经过选育筛选出的可产蛋白酶且性能相对稳定的菌株、斜面培养基、浓度为0.05%的硫酸镁、浓度為0.1%的磷酸二氢钾、浓度为2%的琼脂以及浓度为97.85%的玉米糖化液。

将上述所有物质的调垂度调整到10。选择摇瓶作为发酵培养基，采用浓度为10%的天然大豆粉配合90%的水，同时加入乙醚、硫酸镁、磷酸二氢钾和盐酸，最后分析提纯。

在仪器设备方面选择超净工作台、高压灭菌锅、电热恒温水浴锅、电热恒温培养箱、高速万能粉碎机、pH计以及振荡培养箱。

2.2实验方法

首先对大豆油脂进行发酵，并对发酵液中残存的游离大豆油含量进行测定，可采用乙醚直接萃取，配合差重法计算出大豆油的最终获得量。

2.2.1基于发酵条件的大豆油脂筛选实验

（1）采用微生物分离法分解大豆油脂的底物浓度会对大豆油本身产生一定影响。在浓度为10%的发酵培养基中加入浓度为10%的天然大豆粉，配合浓度为10%的发酵培养基，将pH值调整到5，在120℃的水中灭菌30min，然后接种10%的菌种，在38℃的恒温摇床中培养菌种19h。最后采用发酵过程游离大豆油的含量来提高提油量，并将其作为大豆油脂底物浓度实验的重要评价指标。

（2）大豆原料的粉碎程度也会对大豆油脂产生影响。将大豆完全粉碎后，分别过20、40、60、80和100目筛，最后经过5道目筛称取10g的大豆粉，配合水配成浓度为10%的培养基。而在pH值为5、温度为38℃条件下的恒温摇床中则要再培养菌种19h，最后测量提油量。

（3）大豆油脂提取pH值对大豆油脂本身会产生影响。当大豆粉碎后过80目筛时，称取10g的大豆粉，配成浓度为10%的天然培养基，将培养基中的所有大豆粉pH值调整为6个水平：1、3、5、7、9、11，然后将大豆油脂在恒温摇床中培养19h，最后测量提油量。

（4）分析培养温度对大豆油脂的影响。将大豆油脂完全粉碎后过80目筛，再称取10g的大豆粉配合水配成浓度为10%的培养基。将pH值调整到5，其温度分别控制在32℃、34℃、36℃、38℃和40℃，并在恒温摇床中培养19h，最后等待测量大豆提油量。同理，还要利用该方法进行发酵时间的实验影响分析，在16h、19h、22h、25h、28h的条件下进行提油量测量提取。

2.2.2响应曲面实验

结合响应曲面实验设计，对单因素实验结果进行分析，选择合理的发酵时间，并对其pH值与培养温度、发酵时间等进行分析，获得正确的大豆油脂提取响应变量。在实验中利用Minitab软件配合Box-Behnken原理实施响应面设计分析，然后对微生物发酵法条件下所提取的大豆油脂工艺进行有效处理。最后基于实验因素水平的有效选取，例如在-1水平下实验时间为16h、pH值为3，最终的大豆油脂测量提取温度为34℃。本实验中专门选取了15个实验点，其中有12个为析因点，3个为零点，结合零点展开3次实验，并执行误差估计计算，可获得响应曲面实验结果。

（1）大豆油脂底物浓度对大豆提油量的影响。一般来说，底物浓度的变化会对测定结果产生影响。如果选取底物浓度为6%的大豆油脂，将其浓度逐渐升高到10%，提油量也会随之上升，上升趋势明显。但是在实验中底物浓度不能过高，例如天然大豆培养，若浓度过高就会出现糊状黏度过大的大豆产品，其基质中水分含量偏低，且在38℃的恒温摇床中培养19h会导致基质中的水分进一步降低。因此综合考量，采用微生物发酵法可提取15%左右的大豆油脂底物。

（2）原料粉碎程度对大豆提油量的影响。响应曲面实验中的大豆原料需要粉碎，其粉碎程度会对发酵效果产生一定的影响，例如当大豆原料的粉碎程度越高、粉碎越细时其原料粉对粉碎程度要求就逐渐变高，在实际的大豆油脂生产过程中会结合该粉碎度来提高大豆油脂生产产量。在操作过程中，要基于80目筛作为粉碎基本标准，配合原料综合考量响应曲面实验过程与实验条件。

（3）pH值对大豆提油量的影响。在响应曲面实验过程中发现菌种所产生的蛋白酶对大豆粉的酶解效果明显，而且与大豆初始pH值密切相关，pH值会影响到菌种的产酶量，直接影响大豆的提油量。如果其pH值为1～4，那么提油量就会随着pH值的升高而逐渐升高；当pH值达到5以后，提油量升高趋势会逐渐放缓，此时提油量也会随之减少。因此选择pH值为5进行发酵可获得初始pH值，此时说明该菌种所产生的蛋白酶其pH值是偏酸性的。

（4）温度对大豆提油量的影响。温度在微生物法中对提油过程的影响最大、最关键，温度偏高或偏低都可能会影响到微生物本身的产酶及酶的化学作用效果。例如可将温度从30℃上升到36℃，此时大豆油脂的提油量会持续性增加，而且增加趋势相当明显；将温度从36℃上升到40℃，此时提油量则会明显下降。其下降原因主要有两点：第一，实验中的部分菌种在高温状态下失去活性死亡；第二，微生物所产生的蛋白酶在耐热性方面表现不强，出现了变性失活的情况。综合考量要选择36℃为最佳的大豆油脂微生物发酵温度。

3结果与分析

采用微生物发酵配合响应面设计实验，最终结合回归模型获得发酵实验结果。按照回归模型系数的显著性检验结果，残差平方和为99.78%，说明该模型中的数据拟合度较高，具有一定真实性，可基于各个影响因素对大豆油脂的提油量进行综合影响分析，而并非仅仅列出单纯的线性关系。在进一步的回归模型显著性检验中，可发现回归模型的极相当显著，失拟项P=0.027>0.01，这说明模型的拟合度良好，可基于模型和预测生物法来分析大豆油脂中的具体油脂提取量。通过对大豆油脂响应曲面实验结果的直观反映，确定在培养温度为38℃的条件下，大豆油脂的初始pH值为4.5～5.5，发酵时间可控制在19h内，此时提油量可达到极值，初始pH值与发酵时间两大因素相互作用并不明显。当初始pH值达到5时，其培养温度为36℃，發酵时间为19h，提油量能够达到极值。

4结论

本研究利用Minitab软件结合发酵条件响应曲面优化设计，对大豆油脂的提取方法与应用性、预测性进行了全面实验，获得了准确的变量与误差信息，得出了影响微生物法在大豆油脂提油量方面的显著因素，其显著性影响程度从大到小依次为培养温度>初始pH值>发酵时间。最后结合响应面分析方法对微生物发酵法背景下的大豆油脂提取工艺进行了进一步的深度优化，获得了最优的大豆油脂发酵工艺参数，为其他相关实验提供了相关参数指标。