猪瘟单克隆抗体制备实验

岳铃钟秀琼杨粘黄耿耿

（1，贵州省贵阳市白云区动物疫病预防控制中心 550014；2，云南省楚雄州动物疫病预防控制中心 675000；3，贵州省贵阳市白云区动物卫生监督所 550014）

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病。猪瘟呈世界性分布，其危害程度高，对养猪业造成经济损失巨大，一直是国际重点检疫对象，尽管我国兔化弱毒疫苗为控制猪瘟起到巨大作用，但猪瘟仍在我国流行严重。猪瘟E2蛋白一直是猪瘟研究的热点。单克隆抗体以其高度的特异性和敏感性而在CSFV生物学研究中起重要作用。为进一步探索基因疫苗制备单克隆抗体的新方法，本实验构建了CSFV E2基因真核表达质，并用其免疫Balb/C小鼠，用原核表达的CSFV E2抗原作为检测抗原筛选，建立了2株杂交瘤细胞株，这2株单克隆抗体与CSFV能特异性反应并具有中和能力。这是利用基因免疫制备动物病毒单克隆抗体的首次报道，为广泛利用这一技术研制单克隆抗体打下坚实基础。

1 材料

1.1 菌种与质粒、细胞和实验动物

大肠杆菌JM101、JM109、和 BL21(DE3)plysS、 DH5α、BL21(DE3)plysS宿主菌、质粒pET-28a（+）和pVAX1由本室保存由本实验室保存。PK-15、SP2/0细胞由本实验室保存。Balb/c小鼠购买于昆明医学院实验动物中心。猪瘟病毒石门株全长结构蛋白基因以ppocsfv.dna由湖南农业大学余兴龙教授馈赠。

1.2 主要试剂

胰蛋白胨（TRYPTONE）、邻苯二胺（OPD）、30%双氧水（H2O2）、牛血清白蛋白（BSA）、Tween-20、琼脂糖、oligo（dT）、dNTP（上海生物工程有限公司）；新生牛血清、胎生牛血清、DMEM高糖培养基、PRMI-1640培养基（GIBOCO）；HRP标记的兔抗鼠IgG。

2 方法

2.1 猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建

根据Genbank登录的猪瘟病毒石门株E2基因序列设计扩增E2全长基因的上游引物E2Fp GGATCCACCATGGTATTAAGGGGACAGATCGTGC和下游引物E2RP CGGAATTCCTAGTCAAACCGGTACTGATACTCACC。PCR循环参数为95℃变性5min,95℃ 50s,55℃ 50s,72℃ 20s，25个循环。用Agarose Gel Extraction Kit(B.M)分别回收PCR产物，然后用BamHI和 EcoRI双酶切 PCR产物并回收酶切产物，然后连接到pVAX1的BamHI和EcoRI两位点之间。将连接产物转化DH5αE.coli。从转化平板上挑取单个菌落接种到3ml含有卡那霉素的LB培养基中，培养12h后小量提取质粒。将提取的质粒用BamHI EcoRI双酶切，切出目的片段即为阳性重组子，送样测定序列。

2.2 猪瘟病毒E2基因原核表达质粒的构建和表达

将编码猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因的表达载体质粒pET-28a-E2，转入受体菌BL21（DE3）plysS中，IPTG诱导表达了具有抗原性的E2蛋白。包涵体提取后用20mM的Tris-HCl（pH8.0）悬浮，与4倍SDS-PAGE上样缓冲液煮沸10～15min待包涵体彻底溶解后，进行PAGE电泳，检测含量和纯度。

2.3 动物免疫

选择8～12周龄Balb/c小鼠6只，每只小鼠后肢胫前肌注射脂质体包被的基因疫苗pVAXE2，注射剂量每只小鼠注射含20μg共100μl的基因疫苗，共注射6只小鼠，免疫5次，每次间隔两周，每次免疫同样剂量的细胞，融合前一周再加强免疫一次。

2.4 基因免疫小鼠的血清抗体检测

免疫2次和3次后5d，从小鼠尾部采血，1：200倍稀释，用重组纯化的E2蛋白（每孔包被量为40μg）为检测抗原，以牛血清白蛋白为封闭剂，间接ELISA检测基因免疫小鼠血清抗体水平。

2.5 饲养细胞的制备

取健康小鼠眼球采血，颈椎脱臼处死，至于75%酒精5～10min，无菌条件下，用剪刀在小鼠腹部剪一小口，两侧撕开腹部皮肤。用一次性无菌注射器向小鼠腹腔内注入5ml 1640完全培养基，并用摄子轻轻摇动小鼠腹腔。用无菌注射器吸出小鼠腹腔内注入的培养基，此过程需注意避免操作污染的发生。加1640完全培养基至15ml，混匀，用移液器将其加入96孔板中，50μl/孔。放置于37℃ 5%CO2培养箱内过夜培养，以备次日融合用。

2.6 杂交瘤细胞融合

将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，1200rpm离心8min，弃上清。用滴管吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。在室温下融合：30s内加入预热的50%PEG4000，边加边旋转离心离管，使细胞与PEG充分接触；作用90s；加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml，2ml，4ml，13ml。800rpm离心6min，弃上清，沉淀即为此次融合的细胞。对此细胞再洗一次，尽量除去残余的PEG，以免影响后续实验。加入10ml含20%小牛血清的1640培养液轻轻混悬，勿用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。将融合细胞加入到含有饲养细胞的96孔培养板中，每孔50μl，放入37℃ 5%CO2培养箱中培养。次日换为HAT选择培养基培养两周，而后改为HT选择培养基培养两周。

2.7 杂交瘤细胞克隆

克隆前先用两只健康Balb/C小鼠的腹水作饲养细胞铺板，用完全培养基将阳性孔中的融合细胞吹打，移至无菌小瓶中，计数后，稀释至每50μl中含有一个细胞。然后，将稀释的细胞悬液滴入已铺有饲养细胞培养板内，每孔50μl。置入5%CO2温箱37℃培养，次日补加1滴完全培养基，每天观察一次，发现污染立即用1N NaOH消除污染，3d左右换液一次，换液时要特别小心，每孔一个灭菌好的吸头，观察每孔有几个克隆株，一般1个克隆株的孔占多数，对有两个或没有细胞的孔，分别作出标记。待克隆细胞生长至8～10d时进行检测，标出阳性孔。同时，对所有的孔均换液，2d后，再检测。将两次检测OD值高的孔再次进行克隆，直到所有的孔都为阳性，最后选择OD值高、细胞活力好、只有一个克隆的细胞孔扩大培养，液氮保存，同时收集其上清，放-20℃冰箱冻存。

2.8 腹水的制备

将0.5ml的高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔，一周后注入1×106个杂交瘤细胞于小鼠腹腔，7～10d后当小鼠腹部极度膨胀时，抽取腹水，1500r离心10min，取上清，56℃灭活30min，加入50%的甘油，进行小包装分装，放-20℃冰箱冻存，待用。

2.9 杂交瘤细胞上清和腹水效价的测定

将杂交瘤培养的上清分别作64、128、256、512和1024倍稀释，阴性对照为SP2/0培养上清。制备的腹水分别进行1∶103、104、105、106、107倍稀释，阴性对照用SP2/0制备的腹水作同样倍数的稀释，进行间接ELISA检测，P/N值＞2的最高稀释倍数即为上清和腹水效价。

3 结果

3.1 pVAXE2的鉴定结果

将连接产物转化E.coli感受态，小提质粒，用BamHI和EcoRI酶切，切出1047bp目的片段，筛选得到阳性克隆。然后双向测定序列，与PPOCSFV.DNA完全符合，证明构建正确。pVAXE2中的E2基因含信号肽无跨膜区（1047bp在兔化弱毒株基因组2379～3425位置），酶切鉴定。猪瘟病毒E2重组质粒的酶切结果，见图1。

图1 pVAXE0和pVAXE2的酶切鉴定结果

3.2 重组菌、E纯化E2蛋白的PAGE电泳和薄层扫描测定纯度的检测

下页左图可见重组E2菌中呈现于预计分子量大小相同的表达产物，二对照菌则没有；E2蛋白的纯化用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量（图中），按Peirce试剂盒说明书进行，中图可见不同含量的纯化的重组E2纯化效果及western bloting特异性检测结果，右图则为薄层扫描测定的纯化E2的纯度达70%。

3.3 免疫小鼠的抗体水平检测结果

以E2抗原为抗原包被酶标板，间接ELISA检测基因免疫小鼠血清，结果表明，6只免疫小鼠均产生明显的抗体应答，第二次免疫后血清中抗体水平明显高于第一次免疫，见表1。

表1 基因免疫Balb/c小鼠血清抗体检测结果

3.4 杂交瘤细胞上清和腹水抗体滴度的检测结果

将获得的17株（10株E2，7株E0）杂交瘤细胞株的细胞培养上清和制备的腹水经间接ELISA检测，上清效价在1∶256～512， 腹水效价在 1： 105～106， 见表 2～3。

4 讨论

E2是瘟病毒的囊膜糖蛋白，在CSFV中E2位于ORF的精氨酸690-谷氨酸1062位，由373个氨基酸残基组成，有5个N端的糖基化位点，这些糖基化位点对CSFV的感染非常重要[1,2]；BVDV的E2位于ORF的2077～3198位核苷酸，由374个氨基酸残基组成，含有19个半胱氨酸残基和5个可能的糖基化位点，这些位点在BVDV的不同毒株都是非常保守的[3]。瘟病毒的E2蛋白多以二聚体的形式存在，在细胞信号肽的作用下从多聚蛋白上游离下来，C端含有疏水的膜锚定区域，锚定在囊膜上。CSFV E2蛋白存在4个独特的抗原结构域A、B、C、D，Wensvoort用13株抗CSFV McAb借助竞争结合法和抗原捕捉测定法研究了CSFV的抗原表位[4]和Van Rinjin通过表达确实突变体证实4个抗原结构域位于E2 N端的690～860位氨基酸残基，其中A区是高度集中的抗原表位集中区；B和C是诱导中和抗体产生的主要部位，均为非保守区；而D区既不保守也不诱导中和抗体的产生。E2是瘟病毒主要保护性抗原，长期以来被称为瘟病毒研究的主要对象，是人们研究新型疫苗的主要靶基因，也是建立CSF血清学检测方法首选抗原。猪瘟E2蛋白一直是猪瘟研究的热点。单克隆抗体以其高度的特异性和高度的敏感性而在CSFV的生物学研究中起重要作用。本研究通过过构建的E2基因的真核表达质粒制备成基因疫苗，通过免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，大量筛选猪瘟病毒杂交瘤细胞株筛选出17株分泌抗E2抗体的杂交瘤细胞株，克隆3次后检测的培养上清和腹水效价分别为1∶256～512和1：105～106。接种猪瘟病毒的PK-15，用17株杂交瘤细胞株的制备的腹水为一抗，以荧光标记的鼠二抗的间接免疫荧光检测结果显示，17株单抗中，有7株呈现强烈的荧光染色，为CSFV的检测和猪瘟病毒的研究提供试剂奠定了物质基础。

图2 重组E2的SDS-PAGE电泳、western bloting和纯化结果

表2 间接ELISA检测杂交瘤细胞上清滴度

表3 间接ELISA检测腹水滴度