再障儿骨髓间充质干细胞体外造血支持作用的研究

朱岩，钟佳伟

（兰州市安宁区万里医院 儿科，甘肃 兰州 730070）

0 引言

再生障碍性贫血是因机体造血增生不良以及外周血全血细胞减少而引起的出血、反复感染、贫血为主要临床特征的一组综合征，该病由某种或多种复合因素引起，属骨髓造血功能衰竭性疾病。为了进一步了解再障儿骨髓间充干细胞造血支持作用，本研究以近年收治的该类患儿为研究对象，通过实验观察患儿骨髓间充质干细胞的造血作用，为临床治疗提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取我院2010年至2015年收治的再生障碍性贫血患儿17例进行研究，符合再生障碍性贫血诊断标准并经实验室检查确诊[3]，男8例，女9例；年龄3-12岁，平均（4.9±1.3）岁。所有患儿确诊并经监护人同意后，从患儿髂前或髂后上棘抽取其骨髓标本，并进行网织红细胞、血常规、流式细胞学、骨髓涂片、骨髓活检等。另选取5例健康成人作为对照组，男3例，女2例，均抽取其骨髓标本。

1.2 方法

（1）骨髓标本的采集。研究组患者髂前或髂后上棘穿刺抽取5 mL骨髓液；对照组骨髓标本来源于健康成人肋骨处骨髓液。

（2）分离培养间充质干细胞。①将骨髓标本进行稀释，采用1.077 g/mL Ficoll-Paque分离液离心分离单个核细胞；②将单个核细胞接种于培养瓶中，培养体系为低糖DMEM培养液（由加拿大wisent公司生产，货号：sc-224478）（内含10%胎牛血清），细胞浓度维持在1×106mL；③培养瓶放入培养箱培养48h，更换培养液，并观察细胞贴壁情况，去除未贴壁细胞；④每3-5 d更换一半培养液,细胞生长融合＞80%成片存在时以0.25%胰酶消化，传代至第3-6代的细胞待用[1]。

（3）观察间充质干细胞生物学特性。将（2）的间充质干细胞接种于24孔培养板至细胞长满80%消化传代，记录每次传代的细胞数量及形态；收集第3代间充质干细胞并测定其细胞表型。

（4）间充质干细胞对脐血淋巴细胞转化的影响。①脐血取自健康新生儿，12 h用密度梯度离心法分离出单个核细胞，置含20%胎牛血清RPMI1640培养液（由美国Invitrogen公司生产，货号：12633-012）中培养24 h，取悬浮细胞即为淋巴细胞。②待骨髓间充质干细胞生长到80%-90%融合时，进行丝裂霉素C处理，并依据不同浓度将其接种于孔板中（96孔）；淋巴细胞悬浮于RPMI1640中，然后分别与研究组、对照组骨髓间充质干细胞接种，刺激淋巴细胞转化浓度控制为5 ug/mL，在培养箱中培养96 h，然后在培养结束前12 h记录cpm值[2]。

（5）观察间充质干细胞对脐血造血细胞体外扩增的影响：①脐血单个核细胞的制备同上，然后取3-6代研究组患儿与对照组1mL骨髓间充质干细胞悬液接种于24孔板，并用丝裂霉素C处理，然后将不同培养体系的脐血单个核细胞接种于培养板（24孔）。实验分为三组：脐血单个核细胞+细胞因子组合组，为第1组；脐血单个核细胞+对照组骨髓间充质干细胞+细胞因子组合组，为第2组；脐血单个核细胞+研究组患儿骨髓间充质干细胞+细胞因子组合组，为第3组，其中间充质干细胞数量均为2×105，均置于培养箱中培养7 d。②细胞收集。先吸出非贴壁细胞，以0.25%的胰酶消化贴壁细胞，吹打成单个核细胞悬液加入低糖DMEM培养基中置培养箱中培养，1 h后取上层非贴壁细胞与之前吸出的非贴壁细胞进行混合即为扩增后细胞。③造血祖细胞集落培养。取1×106个经培养扩增7d的细胞接种于培养基中，每孔1 mL，复种3孔，置培养箱中培养2周，镜下对粒细胞巨噬细胞集落生成单位（CFU-GM）、红系爆式集落生成单位（BFU-E）进行计数。

1.3 数据处理方法

2 结果

2.1 再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞生物学特点

研究组患儿骨髓间充质干细胞原代培养2-3 d后，镜下可见贴壁细胞呈短梭形，单个或成群存在、增殖迅速，培养至10 d细胞扩大融合成单层，至20 d时瓶底基本被铺满，融合达80%-90%。传代培养后细胞呈长梭形，呈放射性或漩涡状迅速生长[3]。

2.2 再生障碍性贫血间充质干细胞对脐血造血细胞体外扩增的影响

在相同细胞因子组合作用下，对照组骨髓间充质干细胞与脐血间充质干细胞培养扩增后的CFU-GM和BFU-E产率高于研究组和单纯细胞因子组（P＜0.05），见表1。

表1 研究组患儿间充质干细胞对脐血造血细胞扩增的影响

3 讨论

再生障碍性贫血的发病机制，临床上有种子学说（造血干细胞内的增殖能力受损）、虫子学说（免疫机制紊乱）以及土壤学说（造血微环境缺陷）等观点。目前，临床较为普遍的观点认为免疫异常在再生障碍性贫血的发病中起关键作用，尤其是免疫系统中的T淋巴细胞，其可对造血系统产生攻击性损害，并产生大量造血负调控因子，从而参与再障碍的发病过程[5]。

有研究表明，骨髓间充质干细胞为造血微循环中的重要一环，参与调节造血干细胞的生长与分化。临床上对于再障儿的研究多集中于免疫抑制异常，其骨髓间充质干细胞的生物学特性研究较少[6]。

综上所述，再障儿与健康者的骨髓间充质干细胞的生物学特性无显著区别，而前者对脐血淋巴细胞转化的抑制效应和体外造血支持作用低于后者。