低产乙醇酵母的筛选及其在桑椹酒中的应用

李 希， 肖露露， 马永昆，2， 吴 梦， Tchabo William， Kwaw Emmanuel

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013； 2.镇江市果圣源食品科技有限公司，江苏镇江 212000)

桑椹(FructusMori)为桑科桑属多年生木本植物桑树的果实。我国种桑养蚕有五千多年的历史，是中华民族农业文明中最重要且最具影响力的标志之一。随着我国养生健康战略的实施及人们对桑椹营养功能价值认识的加深，由几千年来单一的“种桑养蚕”向“栽桑养生”转变发展已成为必然趋势。据《本草纲目》等医学典籍记载，桑椹有“固气益肾、乌发明目、安神、解酒毒”等功效[1]，已被我国卫生部列入“既是食品又是药品”的名单[2]。相关研究表明，桑椹含活性多糖、花青素等，具有清除自由基、增强免疫力等作用[3-4]。

随着生活水平的提高，现代人们更加追求营养和健康养生，低醇酒和无醇酒很可能是将来的发展方向。GB/T 15037—2006《葡萄酒》中定义低醇葡萄酒的乙醇度为1%～7%(体积分数)，但没有关于低醇果酒的具体标准。目前生产低醇果酒的方法主要分为生物法和物理脱醇法。商业化的的物理脱醇方法主要为反渗透法[5]和渗透蒸发法[6]，但是最终酒中营养物质和香气成分含量较少，且成本高[7]。用生物法包括限制发酵法、特殊酵母如非酿酒酵母[8-9]和基因工程菌株[10]等方法来控制乙醇的产生，成本低，更具竞争力。

目前用于发酵果酒的酵母绝大部分是商用葡萄酒酵母，虽然活性高、发酵快，但不一定适合桑椹酒。本研究拟通过筛选低产乙醇酵母来制备低醇桑椹酒，在桑椹自然发酵液和菌种公司推荐的用于奶酪生产的复合菌种中进行分离纯化，结合18S rDNA序列分析和系统发育树的构建以鉴定菌株，并发酵桑椹汁酿造低醇桑椹酒，分析其花青素、多酚、黄酮等活性成分、香气成分，结合感官评价筛选出更加适合发酵低醇桑椹酒的酵母，旨在为生产低醇果酒提供优良酵母。

1 材料与方法

1.1 材料

桑椹品种为镇椹1号，采自位于镇江江心洲的镇江桑树圃。培养基为孟加拉红(虎红)培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)，购自杭州微生物试剂有限公司。酿酒活性干酵母，购自安琪酵母股份有限公司，编号为AQ1。

1.2 菌株的筛选及鉴定

1.2.1 菌株的筛选 用无菌铲将桑椹果实捣碎后放入装有灭菌YPD培养基的锥形瓶内，于28 ℃发酵1周，在含有氯霉素的孟加拉红培养基平板上稀释涂布，倒置后于28 ℃培养 2 d。挑取具有酵母菌菌落形态特征的单个菌落，在YPD琼脂培养基上划线分离纯化直至镜检为纯种并编号，然后划线在YPD试管斜面上，于4 ℃冰箱保存，每3个月转接1次。实验室保存的用于奶酪发酵的复合菌种，其分离方法同上，并编号。

将菌株接到装有杜氏小管的YPD液体培养基中，于 28 ℃ 培养，观察并记录菌株的产气情况。将具有产气现象的菌株接到桑椹汁(总糖含量为140 g/L，加入浓度为120 mg/L 的偏重亚硫酸钾)中，于25 ℃发酵1周，离心后测定乙醇度(体积分数，下同)并闻香。

1.2.2 菌株的鉴定

1.2.2.1 形态学鉴定 将菌株在YPD固体培养基上于 28 ℃ 培养，待长出明显菌落后观察其菌落特征，通过显微镜观察其细胞形态。

1.2.2.2 分子生物学鉴定 采用冻融法提取DNA，以菌悬液为反应底物扩增18S rDNA进行菌种鉴定，所用的正反引物为ITS1、ITS4，其序列分别为5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′、5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。首先挑取1个单一菌落接于1 mL无菌水中并打匀制成菌悬液。25 μL PCR反应体系：8.5 μL超纯水，各1 μL正反向引物，12.5 μL PCR Supermix，2 μL待测菌悬液。PCR扩增体系：95 ℃ 10 min；95 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。

采用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增的DNA片段，检测后将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。利用Bioedit对序列测定结果进行分析，并在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上提交序列进行分析，用Clustal W软件进行序列比对，并用软件Mega 5.1进行系统发育树构建。

1.3 低醇桑椹酒的制备

将菌株及活性酵母接到桑椹汁(总糖含量为140 g/L，加入浓度为120 mg/L的偏重亚硫酸钾)中，于25 ℃发酵1周后过滤进行18 ℃后酵1周，然后过滤杀菌，测定其理化指标、挥发性香气成分，并进行感官评定。

1.3.1 理化指标测定 乙醇度、总糖含量(以葡萄糖计)、总酸含量(以苹果酸计)的测定参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；总花青素含量的测定采用pH示差法[11]；总多酚含量的测定采用福林酚比色法[12]；总黄酮含量的测定采用紫外分光光度计法[13]。

1.3.2 桑椹酒香气测定 桑椹酒香气萃取方法：取5 mL样品，加入15 mL顶空瓶中，同时添加1.0 g NaCl和适量内标物正丙醇，放入圆柱形磁力搅拌子，盖紧带内垫的瓶盖，于40 ℃加热平衡 10 min，然后将萃取针头插入顶空瓶中，使之与液面保持 1.0～1.5 cm距离，萃取30 min，磁力搅拌速度为 800 r/min。

气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometer，简称GC-MS)参数条件：(1)色谱条件。色谱柱DB-WAX柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，萃取头解析 5 min，进样口温度为250 ℃，载气(He)流量为1.0 mL/min，不分流进样。程序升温：50 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至220 ℃，保持7 min。质谱条件：5973型四极杆质谱仪，接口温度为250 ℃，电子轰击(EI)离子源，电子能量为70 eV，电子倍增器电压为1 353 V，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，质量扫描范围为33～450 amu。

(2)定性分析。数据收集采取谱库检索法，用HP化学工作站软件对照NIST98库进行对比，成分先由谱库初步鉴定，对正反匹配度大于800的物质予以确认，再结合相关参考文献进行定性[14]。

1.3.3 桑椹酒感官评价方法 以GB/T 10220—2012《感官分析 方法学 总论》和GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》为依据，参考袁小单的方法[15]制定低醇桑椹酒感官评价标准，详见表1。由10名具有相关经验的人员对桑椹酒的外观、香气、口感、总体接受程度进行等级感官评定，1分表示非常不喜欢；2分表示不喜欢；3分表示既喜欢也不喜欢；4分表示喜欢；5分表示非常喜欢。根据各项得分计算总得分，求取平均值作为相应得分。

表1 桑椹酒感官评价要求

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 17.0、Origin 9.0进行数据分析及作图。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

从桑椹自然发酵液中筛选出具有酵母菌落特征和细胞特征的菌株22株，编号为Z1～Z22，从复合奶酪菌种中分离得到3株菌株，编号为D1、D2、D3，共计25株，其中不发酵的菌株3株，剩下的22株菌株的乙醇度及闻香评分结果见表2。可以看出，乙醇度在1%～7%之间的菌株有10株，即为符合筛选目标的菌株，通过闻香打分，淘汰掉得分低于70分的菌株，筛选出4株得分较高的菌株进行鉴定，其编号分别为Z5、Z8、Z9、D1。

表2 不同菌株的乙醇度及闻香评分结果

注：不作主要研究的菌株编号及评分以“—”表示。

2.2 菌株的鉴定

对筛选出来的4株菌株进行鉴定，结果显示，菌株D1的菌落特征为边缘整齐、奶油状、光滑凸起、灰白色，在显微镜下呈卵圆形，出芽生殖，Z5菌落为白色，呈奶油状光滑，Z8和Z9菌落干燥，边缘不整齐，呈现灰白色。相关菌株的DNA序列比对结果见表3，系统发育树见图1。根据亲缘关系的远近，分别可将菌株D1、Z5归为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)，将Z8、Z9归为发酵毕赤酵母(Pichiafermentans)。

表3 菌株的鉴定结果

2.3 不同酵母发酵低醇桑椹汁的基本指标检测及分析

桑椹含有丰富的花青素、多酚、黄酮类物质等活性成分，具有抗氧化等功能[16]，而在桑椹发酵的过程中，其活性成分如花青素含量会由于光、温度、金属离子、pH值等因素而降低，使其功效受到一定的影响[17-18]。

由表4可知，4种桑椹酒的乙醇度存在显著差异，其中Z5产乙醇量最低，为2.87%，AQ1发酵酒的乙醇度显著高于其他酵母。对于活性成分含量来说，AQ1发酵酒的花青素含量最高，可能是由于花青素易溶于乙醇；Z8发酵酒的花青素含量最低。D1发酵酒的总多酚含量最高，为1.768 2 mg/mL，与Z5、Z8、AQ1发酵酒间总多酚含量具有显著差异，不同酵母发酵的桑椹酒多酚含量存在一定差异，一方面是由不同酵母对酚类物质的吸附作用不同引起的[19]，另一方面是由发酵过程中各种多酚不同程度的氧化、水解、聚合而引起的[20]。D1发酵的桑椹酒总黄酮含量与Z5发酵酒的总黄酮含量相比其他酵母发酵的桑椹酒总黄酮含量差异显著，可能与不同酵母在发酵代谢过程中黄酮类物质自身含有的酚羟基和羰基的氧化、聚合作用程度不同有关[21]。

表4 不同酵母发酵桑椹酒的指标测定结果

注：同列数据后标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)。表6同。

2.4 不同酵母发酵桑椹酒的挥发性香气成分分析

果酒的香气是评价果酒品质的重要指标，Lema等研究发现，酵母菌是影响葡萄酒香气成分的重要因素[22]。由表5可知，从4种菌株发酵的桑椹酒中共检出49种主要香气物质，包括11种醇类、26种酯类、7种酸类、2种酮类、3种醛类，其中含量较高的香气成分是异戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯，这与孙玉霞等采用葡萄酒活性干酵母发酵所得桑椹酒的主要挥发性香气成分大部分相同[23]，但是低醇酒香气成分的酯类物质乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯含量要高于醇类物质异戊醇、苯乙醇，这一点与普通酵母发酵桑椹酒相反。

不同酵母发酵的桑椹酒间挥发性物质种类、含量存在一定差异，由表5可知，D1发酵酒中检出的醇类物质最丰富，为11种，但AQ1发酵酒中的醇类含量明显高于其他酵母，其中含量相对较高的醇类有异戊醇、苯乙醇等。异戊醇属于高级醇，是由酵母分解异亮氨酸生成的，具有苦杏仁味、涩味[24]，在AQ1发酵酒中含量最高，其次是在D1发酵酒中。4种酵母发酵的桑椹酒中产生的酯类物质种类分别为22、10、16、15种，在D1发酵酒中最丰富，在Z5发酵酒中最少，其中乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯含量相对较高，对桑椹酒香气贡献较大，在AQ1发酵酒中酯类含量最低。D1发酵酒中独有的异戊酸乙酯、乙酸苯甲酯以及高含量的苯乙酸乙酯等具有愉快的甜香、蜜香、香蕉香[25]。乙酸苯乙酯具有舒适的蜜香、花香[25]，在Z8发酵酒中含量最高，与正丙醇含量的比值为28.81，其次是在D1发酵酒中，与正丙醇含量的比值为21.59。乙酸是4种桑椹酒中共有的酸类，可赋予酒醋酸味。在Z8发酵酒中检测到具有腐败味、不愉快的脂肪味[26]的异戊酸、辛酸、癸酸，给果酒带来不愉快的气味。除此之外，在D1、Z8、AQ1发酵酒中检出醛类物质，少量的壬醛、癸醛会使果酒具有柑橘香和甜橙香。但在AQ1发酵酒中检测出乙醛，会给果酒带来刺激气味[25]。

表5 不同酵母发酵桑椹酒的主要香气成分

序号化合物名称与内标物含量的比值D1Z5Z8AQ124 乙酸己酯——0.05—25 醋酸异辛脂——0.02—26 辛酸乙酯0.05—0.080.0627 壬酸乙酯0.09———28 癸酸乙酯0.080.080.560.4529 丁二酸二乙酯0.03———30 苯甲酸乙酯0.150.160.190.0531 乙酸苯甲酯0.03———32 苯乙酸乙酯0.110.060.100.0833 乙酸苯乙酯21.594.1128.813.7834 己酸-2-苯乙酯0.15—0.32—35 丙酸苯乙酯0.39—0.14—36 异戊酸苯乙酯———0.0837 棕榈酸乙酯0.03—0.06—酸类物质0.432.011.481.3638 乙酸0.352.010.760.4939 异丁酸0.04———40 异戊酸——0.07—41 2-甲基己酸0.04——0.0242 辛酸——0.230.8543 壬酸——0.16—44 癸酸——0.26—酮类物质—0.180.030.1145 3-羟基-2-丁酮—0.100.03—46 大马士酮—0.08—0.11醛类物质0.04—0.100.2147 乙醛———0.1248 壬醛0.02—0.050.0949 癸醛0.02—0.05—

注：“—”表示未检测到该香气成分。

2.5 不同酵母发酵桑椹酒的感官评定结果

由表6可知，D1、Z5、AQ1发酵的桑椹酒外观易被接受和喜欢，三者之间无显著差异，但三者与Z8发酵酒存在显著差异，Z8发酵酒颜色欠佳可能与其发酵过程中总花青素损耗较大有关；对于香气来说，D1发酵酒与Z5、Z8、AQ1发酵酒存在显著差异，D1发酵酒的果香、醇香平衡，Z8发酵酒的整体花香突出，但是果香弱，这可能与其香气中酯类物质如乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯含量较高有关，AQ1发酵酒由于乙醇含量高而使整体醇香浓，果香较淡；在口感方面，D1发酵酒口感柔和爽口，AQ1发酵酒醇感突出、平淡，Z8发酵酒口感酸苦。总体来说，D1菌株更适合用于发酵低醇桑椹酒。

3 结论

从桑椹自然发酵液和奶酪复合菌种中进行分离得到产乙醇能力较低的4株菌株D1、Z5、Z8、Z9，经过18S rDNA序列同源性分析和系统发育树的构建，判断菌株D1、Z5分别为Kluyveromyceslactis、Hanseniasporauvarum，Z8、Z9为Pichia

fermentans。通过测定各菌株发酵桑椹酒的各项指标、香气成分及感官评价，表明不同酵母发酵的桑椹酒品质存在一定差异，其中D1发酵酒较其他酵母发酵酒具有较高含量的总多酚、总黄酮等活性成分，香气成分种类丰富，醇类、酯类对香气的贡献较大。感官评价分析表明，D1发酵酒果香、醇香平衡，口感柔和爽口，较其他酵母来说更适合用于发酵桑椹酒。