金水宝胶囊对尘肺模型大鼠的改善作用及其机制

刘 薇，蒋舒凡，涂 雷，胡伟燚，王 涛，王 静*

(1南京市职业病防治院药剂科，南京 210042；2中国药科大学药物科学研究院，南京 210009)

尘肺病是长期吸入粉尘并在肺内潴留为病因，以肺组织弥漫性纤维化为最终结局的全身性疾病。尘肺是机体免疫功能紊乱和多种细胞因子共同作用的结果，其发生过程十分复杂，发病机制尚未完全阐明，探索尘肺病的早期发病机制和寻找安全有效的防治药物依然任重而道远。

冬虫夏草是传统名贵中药，现代药理研究证明具有免疫细胞调节剂和体液免疫抑制剂作用，能够舒张血管，扩张支气管，在呼吸系统疾病和抗纤维化方面具有较好的应用[1-3]。金水宝胶囊的主要成分为发酵虫草菌粉，药理实验证实具有抗炎、止咳、祛痰、镇静、促性腺等作用，其主要药理作用与青海天然虫草相似。为了拓展尘肺病的治疗方法，本研究在临床疗效观察基础上，建立大鼠尘肺模型，系统考察金水宝胶囊药效作用，表明金水宝胶囊对于大鼠尘肺模型的呼吸功能和肺组织病变具有较好的改善作用，药效作用具有一定的时间和剂量依赖性。本研究从血液流变学、血管内皮功能、免疫调节、炎症反应、氧化应激等几个方面探讨金水宝胶囊的作用机制，为本品临床治疗尘肺提供参考和实验依据。

1 材 料

1.1 药品与试剂

金水宝胶囊(江西济民可信药业有限公司，批号：160609)；汉防己甲素片(浙江金华康恩贝生物制药有限公司，批号：1602004)。石英粉(粒径<5 μm，江苏联瑞新材料股份有限公司)，采用生理盐水制备成50 mg/mL悬液供造模用。

水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、瑞氏染液(南京建成生物工程研究所)；转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、内皮素(ET)及卵磷脂(PC)ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)；CD4+、CD8+荧光抗体(深圳达科为生物技术有限公司)；其余试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

KD-160型电子秤(东莞百利达健康器材有限公司)；BSA124S精密电子天平(德国赛多利斯公司)；LBY-N6A自清洗旋转式黏度计(北京普利生公司)；Safire2多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；CELLtac α型血球分析仪(日本Nihon Kohden公司)。

1.3 动 物

SD大鼠，清洁级，体质量180～220 g，雄性，购自浙江省实验动物中心，合格证号：SCXK(浙)2014-0001。大鼠均饲养于中国药科大学使用性屏障系统内，空气洁净度10 000级，实验室温度(24±2) ℃；相对湿度60%～80%；每小时空气交换次10～15次；光照周期：12 h(日)/12 h(夜)，每笼不超过5只。

2 方 法

2.1 剂量设置及依据

金水宝胶囊根据体表面积折算成大鼠为267.3 mg/kg，本实验中大鼠受试剂量设为600、300 mg/kg，分别约相当于临床剂量的2倍和1倍。

汉防己甲素片根据体表面积折算成大鼠为27 mg/kg，本实验中大鼠受试剂量设为30 mg/kg，约相当于临床剂量。

2.2 动物模型的建立

雄性SD大鼠水合氯醛(10%，3 mL/kg)腹腔注射麻醉，卧位固定，于颈部切口，分离肌肉，暴露气管，用1 mL注射器将预吸好的粉尘悬液1 mL经气管慢速注入(10 s)，注射完毕竖立大鼠，胸部按摩双肺，使粉尘进入肺内。注射完毕，缝合颈部肌肉和皮肤，标记并分笼饲养。

根据前期实验及文献报道结果，采用本方法约在造模后3个月左右出现明显的肺组织病变。本课题所用大鼠造模后3个月，进行X射线胸片检查，随机取10只大鼠，取肺组织进行组织病理学检查，以出现轻-中度的肺泡炎(HE染色)和肺纤维化(MASSON染色)作为模型建立成功的标准，随后按照以下方案开始分组给药。

2.3 分组及给药

取上述造模大鼠72只，根据体质量随机分为以下4组：(1)模型组(生理盐水)；(2)阳性药汉防己甲素片30 mg/kg；(3)金水宝胶囊600 mg/kg；(4)金水宝胶囊300 mg/kg，每组18只；另取18只正常大鼠作为正常对照组。

各组大鼠灌胃给药，每天1次，每周给药6 d，连续给药6个月，给药体积均为1 mL/kg。

2.4 检测指标及时间点

分别于给药后1、3、6个月，每个时间点各组取6只大鼠，进行以下指标检测：股动脉采血，经柠檬酸钠抗凝，通过血液黏度计测定全血黏度、血浆黏度，考察受试药物对血液流变学的影响。采用ELISA试剂盒测定血清TGF-β、TNF-α及IL-6水平。另取部分血液，肝素抗凝，流式细胞仪检测血CD4+、CD8+等淋巴细胞数量。试剂盒测定血清MDA和SOD水平。

采血完毕处死大鼠，经主气管穿刺，分4次注入预冷PBS(共6 mL)，每次边按摩肺部边尽量完全回收液体。采用细胞分类计数仪测定支气管肺泡灌洗液中白细胞总数，余下灌洗液以2 000 r/min离心10 min，下层沉淀为细胞，制备涂片经瑞氏染色，油镜下计数200个细胞进行白细胞分类。另取部分支气管肺泡灌洗液，测定ET、NO和PC水平。

2.5 数据处理及统计学方法

3 结 果

3.1 对血液流变学指标的影响

结果显示，模型组动物在造模后1、3、6个月全血黏度和血浆黏度均明显升高(P<0.05，P<0.01)，金水宝胶囊高剂量对于各时间点血浆黏度具有明显的改善作用(P<0.05)，但对全血黏度仅有部分改善作用，未达统计学显著差异。金水宝胶囊低剂量及汉防己片治疗组对于模型大鼠血液流变学指标亦可见部分改善作用，但未达统计学显著差异(表1)。

Groupt/monthWhole blood viscosity (m·Pas)5/s-130/s-1200/s-1Plasma viscosity/(mPa·s)Control11.95±0.311.00±0.220.69±0.190.43±0.1232.86±0.441.65±0.220.88±0.130.53±0.1162.78±0.421.67±0.320.86±0.110.74±0.13Model12.79±0.70*1.47±0.42*1.03±0.22*1.41±0.62**33.95±0.47**1.97±0.19*1.12±0.21*1.22±0.19**63.56±0.51*2.25±0.39*1.27±0.40*1.25±0.19**Tetrandrine(30 mg/kg)12.53±0.321.23±0.260.82±0.180.89±0.1533.32±0.531.83±0.141.02±0.201.01±0.1663.34±0.502.08±0.421.02±0.141.05±0.22JinShuiBao(600 mg/kg)12.24±0.311.11±0.360.90±0.120.77±0.27#33.39±0.521.70±0.231.02±0.190.85±0.12#63.16±0.141.94±0.221.00±0.220.95±0.18#JinShuiBao(300 mg/kg)12.40±0.611.22±0.321.00±0.141.26±0.3733.58±0.491.77±0.131.06±0.141.05±0.1863.26±0.242.04±0.241.01±0.191.07±0.12

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05vsmodel group

3.2 对血中炎症因子和免疫细胞的影响

在6个月试验期间，模型大鼠血清TGF-β、TNF-α和IL-6炎症因子均显著升高(P<0.05，P<0.01)。金水宝胶囊高剂量可明显降低血清TGF-β、TNF-α和IL-6水平，低剂量对血清炎症因子也部分的改善作用。汉防己甲素对血清炎症因子具有明显的抑制作用(P<0.05，P<0.01)(表2)。

与正常动物相比，模型大鼠CD4+和CD8+/CD8+水平均明显升高(P<0.05，P<0.01)，金水宝胶囊高剂量均能显著降低CD4+/CD8+水平(P<0.05，P<0.01)，低剂量也有部分改善作用。汉防己甲素也可以明显降低CD4+和CD4+/CD8+水平(P<0.05，P<0.01)(表3)。

Groupt/monthTGF-β/(pg/mL)TNF-α/(pg/mL)IL-6/(pg/mL) Control1347.9±67.033.9±8.191.8±7.33387.0±89.837.2±7.690.9±7.36372.4±86.036.8±5.994.1±8.5Model1542.0±73.3**51.7±6.4**114.0±12.3**3505.0±63.4*51.0±6.3**112.0±7.7**6492.3±55.5*51.9±9.5**119.8±13.3**Tetrandrine(30 mg/kg)1402.8±54.5##40.8±7.0#98.7±8.7#3402.2±49.4#41.3±6.1#101.3±4.4#6392.1±64.1#39.5±9.6#97.7±13.5#JinShuiBao(600 mg/kg)1421.2±85.3#39.4±6.6##94.4±11.5#3403.6±88.5#40.1±6.8#99.4±8.8#6380.4±73.6#38.7±9.4#104.3±10.3#JinShuiBao(300 mg/kg)1480.8±55.742.8±8.895.4±9.1#3415.4±60.2#41.8±8.0#100.9±9.96385.9±73.7#36.7±9.9#105.4±12.0

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

Groupt/monthCD8+(%)CD4+(%)CD4+/CD8+Control115.6±1.721.8±5.31.40±0.26313.7±2.521.5±3.31.59±0.26613.1±2.220.9±2.51.61±0.23Model113.4±1.328.3±1.2*2.12±0.12**316.7±1.2*31.9±2.0**1.91±0.13*613.4±2.728.4±2.8**2.17±0.31*Tetrandrine(30 mg/kg)112.7±1.922.4±1.2##1.78±0.17##317.5±1.028.1±0.8##1.61±0.08##613.9±1.625.0±1.1#1.81±0.14#JinShuiBao(600 mg/kg)116.1±3.925.9±4.21.67±0.38#316.9±1.727.1±1.8##1.61±0.09##616.8±2.329.8±2.31.79±0.12#JinShuiBao(300 mg/kg)112.1±2.023.8±1.6#2.01±0.25316.0±3.729.9±3.71.90±0.19611.5±3.621.2±2.2##2.00±0.66

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

3.3 对血清氧化应激相关指标的影响

结果显示，6个月试验期间，尘肺模型大鼠血清MDA水平显著升高，而SOD活力显著下降(P<0.05，P<0.01)，金水宝胶囊高剂量可明显降低模型大鼠血清MDA水平，并升高SOD活力(P<0.05)，低剂量也可见部分改善作用。汉防己片对模型大鼠血清MDA和SOD水平未见明显影响(表4)。

3.4 对支气管肺泡灌洗液细胞分类计数及成分的影响

与正常大鼠相比，尘肺模型大鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞数量显著增加(P<0.01)，白细胞分类计数可见巨噬细胞比率明显降低(P<0.01)，中性粒细胞和淋巴细胞的比率明显增高(P<0.01)。与模型组相比，金水宝胶囊高剂量可明显降低模型大鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞数量，同时对于白细胞分类也有明显调节作用(P<0.05，P<0.01)，低剂量部分时间点也可见较明显的改善作用。汉防己甲素也可显著降低模型大鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞数量，同时对于白细胞分类也有明显调节作用(P<0.05，P<0.01)(表5)。

Groupt/monthMDA/(nmol/mL)SOD/(U/mL)Control111.2±2.5132.9±9.1313.1±3.2117.7±8.9613.2±1.9114.8±8.9Model116.4±2.4**114.4±10.5**319.7±4.6*95.4±14.1**617.8±3.4*94.3±17.7*Tetrandrine(30 mg/kg)114.1±4.3123.9±14.5316.0±3.3107.4±7.6615.6±4.5102.1±11.1JinShuiBao(600 mg/kg)112.8±3.1#126.8±6.7#314.6±2.2#115.3±9.2#613.4±2.6#111.8±6.2#JinShuiBao(300 mg/kg)113.7±1.7117.0±15.3315.8±1.8113.4±5.9#614.8±4.4109.3±7.6

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

支气管肺泡灌洗液生化指标测定结果显示，自造模1个月开始，模型大鼠ET和NO水平即显著升高(P<0.05，P<0.01)，而PC水平随着模型的时间进展逐渐升高，自造模第3月起达到统计学显著差异(P<0.01)。与模型组相比，金水宝胶囊高剂量全部试验周期内对支气管肺泡灌洗液ET、NO和PC水平均有明显改善作用，而低剂量第1月具有部分改善作用，而3月后具有统计学显著差异的改善作用。汉防己甲素可明显降低6个月内支气管肺泡灌洗液ET水平(P<0.05，P<0.01)，给药6个月使得NO水平也有明显降低(P<0.05)，同时给药3和6个月PC水平有明显升高(P<0.05，P<0.01)(表6)。

Groupt/monthWBC/(×108·L-1)Ratio/%MacrophagesNeutrophilsLymphocyteControl11.60±0.2387.85±7.432.05±0.583.93±1.0631.88±0.1579.77±4.782.23±0.303.87±0.6061.92±0.2778.62±5.162.57±0.313.43±0.60Model13.10±0.65**73.83±5.95**9.22±0.98**10.20±2.99**32.90±0.40**66.92±6.75**6.32±0.62**11.22±1.75**62.90±0.41**63.57±2.74**7.53±0.85**11.42±1.71**Tetrandrine(30 mg/kg)12.05±0.25##82.95±5.92#6.42±1.07##7.00±0.91#32.18±0.25##75.23±3.66#4.80±0.94##8.12±1.09##62.37±0.29#71.57±5.95#5.22±0.60##8.15±1.00##JinShuiBao(600 mg/kg)12.15±0.34#82.97±4.76#6.67±0.35##7.08±1.39#32.23±0.33#75.55±5.21#5.02±0.56##8.72±1.24#62.33±0.31#72.00±5.65##5.95±0.69##8.68±1.63#JinShuiBao(300 mg/kg)12.28±0.31#79.33±4.456.95±0.40##8.85±1.7632.38±0.33#73.07±6.385.43±0.44#9.65±1.6462.43±0.3669.05±8.306.00±0.58##9.85±1.08

**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

Groupt/monthET/(pg/mL)NO/(μmol/L)PC/(mmol/L)Control111.4±2.839.5±5.30.75±0.18310.6±1.639.7±5.50.88±0.30610.6±3.940.1±4.60.79±0.26Model116.9±2.6**45.7±3.1*0.89±0.42321.5±2.0**46.7±5.2*2.04±0.57**623.5±5.2**50.6±5.2**2.75±0.36**Tetrandrine(30 mg/kg)113.7±1.3#41.2±4.20.68±0.17316.2±1.8##41.8±3.41.29±0.56#615.6±5.7#43.5±2.6#1.41±0.45##JinShuiBao(600 mg/kg)112.7±3.0#40.5±4.3#0.76±0.15314.2±4.0##39.7±5.2#1.11±0.14##614.0±4.8##42.1±3.4##1.34±0.34##JinShuiBao(300 mg/kg)114.3±5.941.1±4.40.78±0.16315.7±4.8#39.9±5.2#1.17±0.47#615.6±3.6#42.4±7.3#1.85±0.46##

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

4 讨 论

尘肺患者由于肺部组织改变、长期缺氧导致血管阻力增加、心肌重构、心功能下降等众多心血管系统改变，同时在炎症因子刺激下，引起血流减缓、血栓形成、血液黏滞，削弱了血液输氧功能，进而加剧机体呼吸困难和机体缺氧[4]。金水宝胶囊高剂量对于尘肺大鼠模型各时间点血浆黏度具有明显的改善作用，对全血黏度有部分改善作用，表明本品对于尘肺状态下血液流变具有一定改善作用。

从尘肺的慢性期到纤维化阶段，肺泡巨噬细胞和上皮细胞释放活性介质及细胞因子，引起白细胞和吞噬细胞的聚集，加剧炎性因子的增多与释放，造成肺损伤[5]。在尘肺致病中的作用，TNF-α通过与其受体结合发挥作用，激活中性粒细胞，改变血管内皮通透性，活化T和B淋巴细胞，参与尘肺的免疫病理反应[6]。有研究表明，IL-6也是介导尘肺炎细胞活化及胶原沉积的重要细胞因子[7]。作为TGF-β可通过上调胶原和纤维黏连蛋白基因的表达而促进细胞外基质的增多，从而参与尘肺的纤维化过程[8]。CD4+和CD8+T细胞是肺部炎症反应时炎性因子的主要来源，模型大鼠CD4+和CD4+/CD8+水平均明显升高，变化趋势与炎症因子水平一致，提示T淋巴细胞的激活和参与。本实验中，金水宝胶囊可明显降低血清TGF-β、TNF-α和IL-6水平，同时显著降低CD4+/CD8+水平，具有一定的剂量相关性，表明本品对于尘肺状态下的系统性免疫细胞活化和炎症反应具有较好的改善作用。

肺心病是尘肺的严重并发症之一，常反复急性加重，随肺功能的损害病情逐渐加重，多数预后不良[9]。研究表明，肺动脉高压是导致肺心病的直接因素之一，而肺组织中ET、NO等血管活性物质与内皮功能障碍密切相关，对肺动脉高压具有关键性作用[10]。肺间质纤维化时伴有Ⅱ型细胞增生，故此时肺泡组织中卵磷脂(PC)水平会明显升高，因此测定支气管肺泡灌洗液中PC水平，可间接反映肺组织纤维化进展程度[11]。本实验中，金水宝胶囊高剂量可明显降低模型大鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞数量，对支气管肺泡灌洗液ET、NO和PC水平均有明显改善作用，提示本品对于尘肺模型的血管内皮细胞功能具有明显的改善作用，同时缓解肺间质纤维化的进展。

当粉尘进入肺内后，主要由肺泡巨噬细胞吞噬清除，粉尘可激活自由基反应，机体内会产生大量的氧自由基，SOD作为氧自由基的清除剂，可能出现消耗性减少；而MDA作为脂质过氧化反应的终产物含量，可能会增多[12]。金水宝胶囊对于模型大鼠血清MDA和SOD水平具有剂量依赖性的改善作用，表明本品可以调节尘肺状态下的机体氧化/抗氧化状态失衡。

由此可见，金水宝胶囊对于尘肺模型大鼠的改善作用涉及血液黏度、全身及肺组织炎症反应、血管内皮损伤、机体氧化应激状态、肺组织纤维化等多方面的作用机制。基于金水宝胶囊改善尘肺模型作用特点和机制的探讨，本研究在后续的实验研究和临床实践中，会更加深入和细致地开展相关工作，不断提升尘肺病的防治水平。