陕西不同产区苹果香气物质差异分析

刘潇然，石金瑞，刘翠华，李 瑞，周 彬，张玉洁，任小林

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨凌 712100)

苹果的品质主要由外观、风味及硬度决定。然而，随着苹果中品质概念的演变，消费者将越来越多的注意力集中在风味属性上[1]。苹果的风味作为一种既独特又重要的品质特征，由味道和香气决定[2]。味道主要由可溶性固形物和有机酸决定，而香气则是由许多挥发性物质组成的复杂混合物[3]。关于苹果中挥发性物质的研究已经超过50 a，共鉴定出300多种挥发性化合物[4-5]，主要包括醛类、醇类、酯类、酮类、醚类和萜烯类。醛类物质大多是具有青香或者青草香及新鲜水果的气味，主要对苹果香味谱的清香特点有贡献。醇类物质的主要气味为清香、新鲜水果味、甜花香和果香等气味。而酯类物质作为苹果香味最重要的贡献者，是成熟果实中果香气味的主要来源[6]。在这些挥发性物质中，仅有一部分香气值大于1的特征香气物质会对果实的总体香味谱起重要作用[7]，也可进一步对香气值进行转化，用lg(香气值)>0来表示。另外，挥发物的种类和含量主要与品种[8-9]、产地[10]、栽培环境[11]、采后处理[12]及贮藏条件[13]等因素相关[14]。

陕西作为中国黄土高原优质苹果产区的重要省份之一[15]，所产苹果以其独特的外观品质和风味优势赢得了国内外消费者的青睐[16]。根据中国统计局数据，2015年陕西苹果总产量达1 037.3万t。‘富士’以其果个大、果型好、肉质嫩细、多汁液、糖酸比高及耐贮运等诸多优良品质，成为陕西省乃至中国的主栽果树品种之一。研究发现，‘富士’苹果的挥发性物质中酯类、醇类和醛类物质的相对含量较高[17]，但对陕西省不同海拔产地‘富士’挥发性物质之间的差异却鲜有报道。本试验采用气相色谱与质谱联用仪对陕西省不同海拔区域的‘富士’苹果的挥发性成分进行分离鉴定。旨在通过分析比较各地区香气组分的异同及其香气活性组分，以期为进一步了解海拔因素对‘富士’苹果挥发性物质的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 分别在韩城市、宝鸡陈仓区、渭南白水县、咸阳彬县、榆林清涧县、延安宝塔区、铜川宜君县的商业果园中于商业采收期采收‘富士’苹果。这些地区海拔见表1，其中韩城海拔最低为457 m，宝鸡最高为1 300 m。选择大小均匀及无机械损伤的果实进行研究。所有果实采摘后立即运回实验室，然后统一放置于0 ℃，相对湿度85%～90%的冷库中贮藏3个月。之后将苹果样品取出，利用四分法，取果皮和果肉的混合样，于液氮中研磨成均匀的粉末，分别装入10 mL的离心管中，置于-80 ℃条件下待测。

1.1.2 试剂 标准试剂：2-甲基-1-丙醇、1-丁醇、1-戊醇、1-己醇、2-甲基乙酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、乙酸己酯、丙酸己酯、己酸丁酯、丁酸己酯、己酸己酯、辛酸己酯、己醛、壬醛、反式-2-己烯醛、α-法呢烯，购于Sigma公司，2-甲基-1-丁醇、丙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、丁酸丁酯、法尼醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、6-甲基-5-庚烯-2-醇，购于Alfa公司，1,3-辛二醇购于Amatek公司，以上标准试剂均用于挥发性物质的定量、甲基叔丁基醚(MTBE)(HPLC高效液相色谱级)主要用于香气物质的萃取，购于美国Tedia公司、用于计算保留指数(RI)的C7-C30烷烃混和标试剂购买自美国Supelco公司，用于香气物质定性和定量分析的所有标准试剂见表2。

表1 7个地区平均海拔Table 1 Average altitude of seven areas

表2 香气物质GC-MS分析所用的标准品试剂Table 2 Authentic standard of aroma compounds used in GC-MS analysis

1.2 仪器与设备

分析研磨机(A11 basic，德国艾卡)、旋涡混合器(QT-1，上海琪特股份有限公司)、超声清洗仪(SB25-12 DTD，浙江宁波新芝生物科技股份有限公司)和氮吹仪(MD-200，杭州奥盛仪器有限公司)，ISQ气质色谱-质谱联用仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 香气物质的提取和GC-MS分析

1.3.1 香气物质的提取 称取2 g研磨样品于10 mL离心管内，加入3 mL超纯水涡旋1 min，待样品与超纯水充分混合后，加入3 mL MTBE和10 μL内标[V(3-壬酮)∶V(甲醇)=5∶30 000]，使用旋涡混合仪混合均匀。然后将其置于超声清洗仪中超声萃取30 min后取出离心(4 ℃，11 000g) 15 min。离心结束后，吸取900 μL上清液至2 mL离心管中，在氮吹仪下缓慢将其浓缩至300 μL，使用0.22 μm的有机滤膜进行过滤后转移至进样瓶，待测。

1.3.2 GC-MS分析 利用气相和ISQ的质谱进行，进样量为1 μL，色谱柱为VF-WAXms(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司)。色谱柱升温程序为：起始温度40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至150 ℃，以8 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。进样口温度为230 ℃，采用不分流进行模式。传输线和离子源的温度均为240 ℃。载气为高纯He(99.999%)，流速为1 mL/min；利用电子轰击离子源，电子能量为70 eV 质谱扫描m/z为33～380。

1.4 挥发性物质的定性和定量

苹果挥发性物质的定性通过NIST库(NIST2014)进行质谱比对，同时结合保留指数(RI)进行。GC-MS分析所得图谱均利用Xcalibur和AMDIS 软件进行解析。定量基于标准物质的校正因子(CF)。

香气物质的定量：基于相应标准试剂的校正因子对各香气组分进行定量计算，其中CF的计算公式为：

CF=[(C1/A1)/(C2/A2)]

其中，C1为标准试剂的浓度,A1为选择离子模式下标准试剂的峰面积，C2为内标3-壬酮的浓度,A2为3-壬酮的峰面积(QI=113)；

进一步各香气组分的计算公式为：

C3=CF×A3C4/A4

其中，CF为被测组分的校正因子，C3为被测组分的浓度，C4为被测样品中内标的浓度，A3为被测组分在选择离子下的峰面积，A4为被测样品中内标的峰面积(QI=113)。

标准试剂品利用MTBE进行稀释(体积比为1∶150 000)，同样加入内标 [V(3-壬酮)∶V(MTBE)=1∶900 000]，然后进行GC-MS分析，进样量1 μL，方法同上。

1.5 数据的处理

GC-MS原始数据文件经Xcalibur和 AMDIS解析，用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0对数据进行分析。

2 结果与分析

不同海拔产地‘富士’苹果挥发性物质的种类和质量分数如表3所示。表3可以看到，不同产地‘富士’苹果中共检测到34种挥发性物质。这些物质可以分为7类：醇类8种，酯类15种，醛类4种，有机酸类2种，倍半萜类2种，酚类2种、酮类1种。在韩城、宝鸡、渭南、咸阳、榆林、延安和铜川分别检测到27、30、34、31、30、29和32种挥发性物质。其中渭南地区检测到的挥发性物质的种类最多，为34种，韩城地区检测到的挥发性物质的种类最少，为27种，宝鸡和榆林地区检测到的挥发性物质的种类均为30种。

由图1可知，7个地区的‘富士’苹果中所检测出的挥发性物质主要为醇类、酯类和醛类物质。这3类物质的质量分数均占总挥发性物质质量分数的93%以上。其中，延安地区的醇类和醛类占挥发性物质总量的比例最高，分别为45.64%和27.19%。而韩城的酯类物质占挥发性物质总量的比例最高，为38.56%。在7个地区的‘富士’苹果中，韩城、宝鸡和榆林这3个地区占比最高的挥发性物质为酯类，而其他4个地区占比最高的挥发性物质则为醇类。

7个地区的‘富士’苹果中，1-丁醇和2-甲基-1-丁醇等丁醇类物质占醇类物质总质量分数的50%以上，在一定海拔范围内，1-丁醇的质量分数随着海拔的升高明显增加，总体表现为先升后降趋势。丁酯和己酯类物质是7个地区的‘富士’苹果中最主要的酯类物质。乙酸丁酯、2-甲基乙酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸乙酯和己酸己酯这5种酯类物质的的质量分数占酯类物质总质量分数的80%以上。在海拔不同7个地区的‘富士’苹果中，己醛和反式-2-己烯醛这2个醛类物质的质量分数占醛类物质总量的89%以上。

图1 7个地区‘富士’苹果中挥发性物质种类占总比例Fig.1 Mass fraction ratios of different volatile components of‘ Fuji’ apples in seven areas

由图2可以看出，随着海拔的升高，挥发性物质的质量分数呈先升后降趋势。挥发性物质的总量及酯类物质的总质量分数在海拔960 m的榆林地区均达到最大，分别为42 778.66和17 725.42 μg/kg。醇类物质的总质量分数则是在海拔835 m的咸阳地区达到最高(16 468.02 μg/kg)。醛类物质的总质量分数随海拔的变化出现先降再升趋势，在海拔1 104 m的延安地区达到最大值(9 162.18 μg/kg)。倍半萜类物质即α-法呢烯质量分数变化趋势与挥发性物质总量的变化趋势相同，即先升后降，在榆林地区达到最大值(977 μg/kg)。有机酸类和酚类物质总含量的最大值分别出现在咸阳和延安地区。另外酮类只在渭南、咸阳以及铜川的‘富士’苹果中检测到。

图2 醇类、酯类、醛类和倍半萜类物质随海拔变化以及挥发性物质总质量分数随海拔变化Fig.2 Alcohols，esters，aldehydes and sesquiterpenes concentration during altitudes and volatile components mass fraction during altitudes

香气值为某种挥发性物质的含量与其香气阈值的比值，lg(香气值)>0的挥发性物质被认为是果实的特征香气成分[38-39]，通过对所有挥发性物质香气值的计算可得表4，由表4可知，在不同产地的‘富士’苹果中共有16种特征香气成分。其中，包含有4种醇类、9种酯类、2种醛类和1种酮类物质。

在韩城、宝鸡、渭南、咸阳、榆林、延安和铜川的‘富士’苹果中的特征香气成分的种类分别为10、11、14、15、13、13和14种，特征香气种类最多的咸阳地区香味最浓郁，而特征香气最少的韩城地区香味在这7个地区中最不浓郁。具有苹果香味的丙酸己酯是渭南地区的‘富士’苹果中独有的特征香气物质。对陕西地区不同产地的‘富士’苹果来说，具有果香气味的酯类物质为其主要的香气贡献组分。

本试验中检测到的醛类物质己醛和反式-2己烯醛主要对苹果的清香气有贡献，酯类物质，如2-甲基乙酸丁酯、乙酸己酯、乙酸丁酯和2-甲基丁酸己酯等主要对苹果的果香有贡献。检测到的4种醇类物质则赋予了苹果以更加丰富的气味，如1-己醇具有青草香味，1-丁醇具有甜香味，2-甲基-1丁醇具有令人愉悦的香味，2-甲基-丙醇具有化学气味。而酮类物质6-甲基-5-庚烯-2-酮则是唯一具有柑橘香和草莓香的物质。

主成分分析是多变量数据降维处理的分析方法[35]，根据香气值大于1的所有香气组分对各个地区‘富士’苹果进行主成分分析。在检测出的34种挥发性物质中，有16种特征香气，这些特征挥发性物质能够体现各个地区‘富士’苹果的香气特点[36]。因此选取香气值大于1的这16种特征挥发性成分对7个地区的‘富士’苹果进行主成分分析。

主成分分析显示(表5)，提取出的6个主成分可以解释初始数据集总方差的100%。其中，第1主成分(PC1)、第2主成分(PC2)和第3主成分(PC3)分别可以解释总方差变异的55.36%、18.22%和12.72%，这3个PCs的累计方差贡献率总和达到86.54%。

表5 各挥发性物质的贡献Table 5 Contribution of volatile components

图3显示不同地区的‘富士’在前3个主成分上的得分分布，从图中可以明显地看出宝鸡、韩城和渭南这3个地区集中在一起。其余地区在3D散点图中并不能明显的看出分布规律。以各个地区在PC1和PC2的得分做二维分布图，可以将7个地区大致分在3个象限。榆林地区的富士苹果在PC1上有极高的得分而在PC1上主要起主要贡献作用的是2种醇类、6种酯类和1种醛类物质即 1-丁醇、1-己醇、乙酸丁酯、丁酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、乙酸己酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸己酯和反式-2-己烯醛，说明这些物质反应榆林地区‘富士’苹果的香气特点。延安地区在PC2上有极高的得分，在PC2上起主要贡献作用的是1种酯类和1种醛类，即2-甲基乙酸丁酯和己醛，说明这2种挥发性物质对延安地区‘富士’的香气特性有着很重要的作用。以各个地区在PC1和PC3上的得分做二维分布图，可以明显观察到咸阳地区的‘富士’苹果在PC3上有很高的得分，根据表4可得对PC3贡献作用较大的是2种醇类2-甲基-1丙醇和2-甲基-1-丁醇和一种酮类6-甲基-5-庚烯-2-酮。

a.7个不同地区3D得分图3-D score plot of the 7 different areas；b.7个不同地区在PC1-PC2上得分图2-D biplots on PC1-PC2 plane scores plot of the 7 different areas；c.7个不同地区在PC1-PC3上得分图2-D biplots on PC1-PC3 plane scores plot of the 7 different areas

3 讨 论

赵峰等[17]的研究表明‘红富士’苹果的香气成分中酯类、醛类和醇类化合物的相对含量均较高，其中以酯类物质的含量最高，因此，将红富士苹果归为了“酯类型”苹果品种，这可能与富士的亲本为‘国光’(醇类型)和‘元帅’(酯类型)有关。这与本试验得到的结果相同，所有地区的‘红富士’苹果的挥发性成分中醇类、酯类和醛类这3类物质的质量分数总和均占相应的挥发性物质总质量分数的93%以上，其中韩城、宝鸡和榆林地区的‘红富士’苹果中占比最高的挥发性物质为酯类，而其他4个地区的‘红富士’苹果中占比最高的组分则为醇类物质。虽然不同地区的‘红富士’苹果中的醇类和酯类物质的质量分数占比不同，但从特征香气的组成上来看，酯类物质的贡献更大，因此可将‘红富士’苹果归为“酯香型”苹果品种。

本试验检测到的挥发性物质共有34种，其中己醛、反式-2-己烯醛、己醇、2-甲基-1-丁醇、1-丁醇、乙酸己酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯、2-甲基丁酸己酯、2-甲基丁酸丁酯、2-甲基乙酸丁酯和α-法呢烯在之前的研究中[10，17，37]均有检测到，是‘富士’苹果中最重要的挥发性物质。另外，陕西7个不同地区的‘富士’苹果中均检测到1，3-辛二醇，该物质在之前的研究中鲜有报道。

有研究表明，同一地区高海拔果园有利于酯类和醛类物质的积累和释放，低海拔果园有利于果实中醇类和酮类等香气物质的积累[40]。何义等[41]研究河北省不同产地‘富士’苹果的香气成分，结果表明海拔较高的承德(375 m)、石家庄(82 m)和邢台(76.8 m)的‘富士’果实中酯类和醛类质量分数较高，海拔较低的秦皇岛(2.1 m)、保定(17 m)的果实中醇类质量分数较高。在本研究中，‘富士’的挥发性物质总质量分数随着海拔升高呈现先升后降趋势，但不同种类挥发性物质达到最高质量分数的海拔不同。醇类物质总量在海拔835 m的咸阳地区最先达到峰值，而酯类和醛类物质的总量则分别在海拔980 m的榆林地区和海拔1 104 m的延安地区达到最大值。本试验中醇类物质相比醛类和酯类物质出现高峰的海拔稍低一些。果实挥发物的合成受许多因素的共同影响，因此，在选取‘富士’苹果栽培地区时也需要考虑海拔因素的影响。

4 结 论

本试验共鉴定出‘富士’苹果的34种挥发性物质组分，包括醇类、酯类、醛类、酸类、酚类、倍半萜类和酮类。从检测到的香气物质的种类和质量分数可得陕西省不同地区的‘富士’苹果香气组份均存在差异。通过香气值的计算，特征香气物质共有16种，主要包括酯类、醇类和醛类等主要香气贡献组份。主成分分析(PCA)结果表明，可以通过特征香气物质的差异将不同产地的‘富士’苹果区分开。榆林、延安和咸阳分别在PC1、PC2和PC3上有很高的得分，而这3个PC分别由酯类、醛类和醇类物质解释。挥发性物质总含量随着海拔的升高，呈现先上升后下降的趋势。其中挥发性物质含量最高的地区是榆林42 778.65 μg/kg，最低为韩城20 969.20 μg/kg。酯类、醛类和醇类物质达到最高值的地区并不相同，分别为榆林、延安和咸阳。