草药白接骨不同方法提取物体外抑菌活性比较

张 森，欧 婧，熊绍斌，赵婵娟

(1. 黔东南民族职业技术学院，贵州凯里 556000； 2. 贵州省雷山县丹江镇农业服务中心，贵州雷山557100;3.重庆三峡职业技术学院，重庆万州)

白接骨(Asystasiellaneesiana(Wall.) Lindau)为爵床科白接骨属草本植物，又名接骨草、接骨丹、血见愁等，广泛分布于我国西南地区，是一味民间常用草药，黔东南地区用其新鲜的根茎或全草，捣浆外敷，治疗跌打损伤、骨折和出血等外科疾病，效果尤佳。《全国中草药汇编》、《纲目拾遗》、《湖南药物志》、《贵州民间药物》等均记载了该草药的功能主治及用法，具有较好临床应用价值。但是该草药的现代药理研究鲜有报道。前期试验发现，白接骨对大肠杆菌、沙门氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌均有较好的体外抑菌效果，是一味具有较好开发前景的民间草药。本试验通过醇提和水提两种常见的方法对白接骨进行提取，观察两种不同的提取方法对白接骨体外抑菌效果的影响，为该民间草药的开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药物与菌株 试验药物：白接骨(全草，2017年7月份采集)由黔东南民族职业技术学院植物组织培养中心鉴定。

试验菌株：大肠杆菌猪(Escherichiacoli)[CVCC 1510], 肺炎克雷伯氏菌(Klabsiellapneumoniae)[ATCC 10031]，由青岛农业大学兽医微生物教研室保存提供；金黄色葡萄球菌(Staphyloccusaureus)[ATCC 25923],沙门氏杆菌(S.choleraesuis) [33HX],由贵州大学动物科学院动物传染病教研室保存提供。

1.1.2 主要仪器与试剂 SW-CJ-2D净化工作台(苏州净化)；LS-30高压灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；KJ14麦氏比浊管(北京哲成科技有限公司)；JA003电子秤(上海舜宇横平科学仪器有限公司)；DHP-500电热恒温培养箱(金坛大地自动化仪器厂)；DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；营养肉汤培养基(杭州百思生物技术有限公司，批号：20170508001)，95%乙醇均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，庆大霉素药敏片(温州市康泰生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 药液制备 将采集的药物置恒温鼓风干燥箱中， 40 ℃条件下烘干。将烘干的药物粉碎成粗粉，备用。

醇提液制备：准确称取10 g药物粗粉，放入三角烧瓶中，加100 mL 80%乙醇，置于超声波机中超声助溶1 h，减压抽滤提取液。按此方法提取3次，合并3次提取液，旋转蒸发仪回收乙醇，给浓缩液中加吐温-80 0.25 mL助溶，再用蒸馏水定容至25 mL，最终药液生药浓度为400 mg/mL，过滤除菌，备用。

水提液制备：准确称取10 g药物粗粉，放入三角烧瓶中，加100 mL蒸馏水，浸泡2 h后，煮沸30 min后，冷却后减压抽滤，二次加100 mL蒸馏水煮沸30 min，冷却后减压抽滤，混合两次滤液，用旋转蒸发仪浓缩，给浓缩液中加吐温-80 0.25 mL助溶，再用蒸馏水定容至25 mL，最终药液生药浓度为400 mg/mL，过滤除菌，备用。

1.2.2 菌液的制备 按无菌操作法，将保存的个菌种划线接种于1%琼脂营养肉汤培养基上，37 ℃条件下培养18 h，挑取单个菌落接种于5 mL无菌营养肉汤液体培养基中，37 ℃条件下培养12 h，用灭菌的肉汤培养基稀释至0.5麦氏浊度，即约1.5×108CFU/mL。取适量菌液用灭菌肉汤培养基进行100倍稀释，菌悬液浓度为1.5×106CFU/mL，备用。

1.2.3 草药白接骨抑菌作用分析 采用管碟法[1]，按无菌操作要求，分别吸取150 μL各配制备用的细菌液至1%的琼脂肉汤培养板上，用“L”棒涂布均匀，在超净工作台上室温条件下放置5 min，等距离放置灭菌牛津杯(规格10 mm×8 mm×6 mm)，静置10 min使其和培养板表面严实无缝。给每个牛津杯中加入相应的药物100 μL，4 ℃放置8 h，使药物扩散，然后将培养皿置37 ℃培养18 h，观察，并用游标卡尺十字法测量抑菌圈直径，取平均值。每种药物和菌株平行做3次重复。结果判定：抑菌圈<10 mm为不敏感，10～19 mm为中度敏感，≥20 mm为高度敏感[2]。

1.2.4 草药白接骨MIC和MBC的测定 采用微量法[3]。按操作方法，取一次性无菌96孔培养板，每行12孔，每孔加100 μL肉汤培养基，吸取100 μL药物加入第1孔，混匀后，吸取100 μL到第2孔，以此类推至第10孔，混匀后，弃100 μL，每孔接种10 μL菌液；第11孔加入10 μL无菌蒸馏水，为阴性对照，第12孔接种10 μL菌液，为细菌生长对照。将96孔培养板加盖置37 ℃恒温培养箱中培养18 h，观察细菌生长情况。结果判定：与阴性对照对比，如浑浊或有沉淀，则判断为有菌生长；如透明度与阴性对照相同，则判断无菌生长。以无菌生长所对应的最低药物浓度为该药物对此菌的MIC。然后，将每孔培养液划线接种1%琼脂营养肉汤培养板，37 ℃培养18 h，观测细菌生长情况，无菌落生成对应的最低药物浓度为该药物对此菌的MBC。每种菌株做3次平行重复。

2 结果与分析

2.1 白接骨抑菌作用结果 通过管碟法观察了白接骨醇提物和水提物分别对大肠杆菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用，结果如表1所示，白接骨醇提液对4种细菌均有较强的体外抑制作用，抑菌圈的直径均超过了20 mm。而对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径超过了40 mm，作用显著强于其他三种细菌。

表1 白接骨抑菌作用结果(单位：mm)Tab 1 The bacteriostatic effect of Asystasiella neesiana (Wall.) Lindau

2.2 MIC测定结果 采用微量法测定白接骨水提液和醇提液对4种细菌的MIC，结果如表2所示，白接骨醇提液抑制大肠杆菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌体外生长的最高稀释倍数分别达到了27(3.12 mg/mL)、28(1.56 mg/mL)、28(1.56 mg/mL)和29(0.78 mg/mL)；而白接骨水提液所有药物稀释浓度均有明显的细菌生长，表明白接骨水提液对这4种细菌无明显的抑制作用。

2.3 MBC测定结果 在无菌条件下，将测定MIC后的每孔液体接种于琼脂平板，37 ℃培养12～18 h，观察是否有菌落生长，结果如表3所示，白接骨醇提液分别在26(6.25 mg/mL)、27(3.12 mg/mL)、28(1.56 mg/mL)和28(1.56 mg/mL)无大肠杆菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌无菌落生长。而白接骨水提液均有明显的细菌生长，与2.2结果对应。

表2 草药白接骨对4种细菌MIC测定结果Tab 2 The MIC of Asystasiella neesiana (Wall.) Lindau on 4 kinds of strain

“P”为细菌生长对照，“N”为空白对照；“-”菌液澄清，“+”菌液轻度浑浊。“++”菌液明显浑浊；“21-210”为药物的稀释倍数

"P"indicated positive control；"N"indicated negative control；"-" indicated the bacteria solution was clear；"+"indicated the bacteria solution was a little muddy;"++" indicated the bacteria solution was apparently muddy; "21-210"indicated the dilute times of medicine

表3 草药白接骨对4种细菌MIC测定结果Tab 3 The MIC of Asystasiella neesiana (Wall.) Lindau on 4 kinds of strain

"P"为细菌生长对照，"N"为空白对照；"-"无菌落生长，"+"有稀疏菌落生长。"++"有大量菌落生长；"21-210"为药物的稀释倍数

"P"indicated positive control；"N"indicated negative control；"-" indicated no colony growth；"+"indicated a small amount of colony growth;"++" indicated a lot of colony growth

3 讨论与结论

随着养殖集约化程度越来越高，畜禽流动越来越频繁，而检疫和防疫水平相对不足，导致我国畜牧生产中病原微生物愈发猖獗。有调查，从我国部分养殖场分离的大肠杆菌和沙门氏杆菌，其中80%以上有多重耐药[6-7]。据研究90%以上的金黄色葡萄球菌可产生β-内酰胺酶，使青霉素水解失活，特别是耐甲氧西林SA(MRSA)，它不仅对甲氧西林耐药，而且对其它多种抗生素亦耐药[8]。此外，在畜牧生产中大量的使用抗生素或抗菌药物，畜产品中药物残留超标，对人类的健康造成一定的威胁。研究表明，某些中草药具有抗病原微生物的作用，由于中药多成分的整体量效作用、多靶点作用和不同于化学药物的抗菌机制，不少具有抗菌作用的中草药对耐药性细菌仍有抗菌作用[9]。

白接骨是广泛分布于我国南部及西南部的爵床科植物，有止血，祛瘀，清热解毒的功效。《纲目拾遗》、《中草药学》、《贵州民间药物》等均有该草药治疗外伤出血，吐血，便血，扭伤及咽喉肿痛病症的记载，是一味我国南方地区常用的民间草药。但其现代药理研究尚未见任何报道。试验采用管碟法联合微量稀释法和琼脂平板计数法观察了其对大肠杆菌、沙门氏杆菌、克雷伯肺炎菌和金黄色葡萄球菌4种兽医临床常见致病菌的体外抑制作用，结果表明，白接骨醇提液对这4种病原菌在体外有较强的抑制作用，其抑菌圈直径均超过了20 mm，经测定，MIC均低于3.12 mg/mL。对金黄色葡萄球菌的作用效果尤佳。其是否在畜牧生产中也有如此卓越的抗菌效果尚需进一步的临床试验。

中草药化学成分繁多复杂，不同的提取部位、不同的提取方法药物效果可能均不同。本试验对白接骨分别采用水提法和醇提法进行提取，进行体外抑菌试验，结果发现，醇提液呈现较好的体外抑菌效果，而水提液没有表现明显的体外抑菌作用，推测白接骨的抑菌成分可能是醇溶性的，而非水溶性。也有学者认为中药在高温煎煮时会造成某些抑菌活性成分被破坏[10]。这也可能是白接骨水提液没有明显体外抑菌活性的原因之一。白接骨目前虽然没有现代药理研究的相关报道，但是穿心莲和白接骨同为爵床科植物，其研究较多，而且已经应用于畜牧兽医临床。据研究穿心莲内脂是穿心莲的主要活性成分之一，属于二萜内脂类，水溶性差，被誉为天然抗生素，对细菌性痢疾的疗效优于氯霉素和呋喃唑酮[11]。白接骨是否具有和穿心莲类似的抗菌成分，尚需进一步的成分分析与药理研究。

综上所述，白接骨醇提液对大肠杆菌、沙门氏杆菌、克雷伯肺炎菌和金黄色葡萄球菌有较强的体外抑菌的活性，而水提液抗菌效果不明显。白接骨是否在动物体内也有强的抗菌效果，其主要的抑菌成分、抑菌机理以及其他的药理作用尚有待进一步的研究。