正交设计法优选七味地藿颗粒多糖的提取工艺研究

杨耀森，褚秀玲

(聊城大学农学院，山东聊城，252059)

研究表明，中药有效成分多糖类作为新的具有生理活性的天然产物，正受到越来越多科研工作者的高度关注[1]。到目前为止，已有300多种多糖类化合物从天然药物中分离出来，其中从植物，尤其是从中草药中提取的水溶性多糖所占比例最大[2]。因此，试验研究针对七味地藿颗粒中的多糖提取工艺进行深入优化研究，其目的在于寻找最佳的提取工艺条件，最大限度地提取组方中的有效成分，充分地发挥其药效[3-4]。

试验运用的七味地藿颗粒是由熟地黄、淫羊藿、菟丝子等7味中药据“君、臣、佐、使”配伍原则配伍而成，七味地藿颗粒具有补肝肾、强筋骨、助阳益精、祛风湿等功效，试验证实[5]，是一个疗效确切的中药组方。该组方中主要的有效成份为多糖、黄酮等。因此，试验以方剂多糖为提取对象，采用水浴提取法[6]，在单因素试验的基础上采用正交试验设计法，研究七味地藿颗粒多糖的最佳提取工艺，为临床生产提供理论基础[7-9]。

1 材 料

1.1 试剂 熟地黄、淫羊藿、菟丝子、黄芪、知母、肉桂、阳起石均购自聊城利民大药店。葡萄糖、浓硫酸和苯酚均购自莱阳经济开发区精细化工厂。

1.2 仪器设备 数显恒温水浴锅(金坛市双捷试验仪器厂)；722可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)；中药万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

2 方法与设计

2.1 多糖含量分析方法的建立 采用苯酚-硫酸显色体系分光光度法测定，并绘制标准曲线。精确称取2 g分析纯葡萄糖标准品，置于100 mL容量瓶中，加重蒸水溶解，定容至刻度线，摇匀得20 mg/mL葡萄糖溶液,备用。

苯酚溶液制备：精确称取5 g苯酚，置于100 mL容量瓶中，加重蒸水使其溶解，定容至刻度线，得到50 mg/mL的苯酚溶液，避光保存，备用。

准确移取400、500、600、700、800、900、1000 μL的葡萄糖标准品溶液，分别置于100 mL容量瓶中，并加入重蒸水定容至刻度线，制成80、100、120、140、160、180、200 μg/mL的葡萄糖溶液。再分别取1 mL该溶液置于干燥试管中，依次加1 mL苯酚溶液，并迅速加入5 mL浓硫酸，混匀，冷水浴20 min，于紫外分光光度计波长为490 nm处测定吸光值，重蒸水作空白对照。以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2 试验设计 根据单因素试验设计方法，研究各因素对七味地藿颗粒中有效成分多糖提取率的影响。然后在此基础上进行正交试验，优化提取工艺。

2.2.1 料液比对方剂多糖提取率的影响 精确称量方剂中这7味中药，共5 份，每份6 g，分别放置锥形瓶中，编号方便记录数据。然后按照料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例分别将蒸馏水加入至每个锥形瓶中，80 ℃水浴提取2 h。将剪裁好的500目过滤纱布放入布氏漏斗内并将提取物倒入布氏漏斗通过抽气泵进行负压抽滤，从而分离到纯净的滤液和药渣。保存滤液并将药渣进行第二次提取，2 h后过滤。合并滤液，并将滤液用蒸馏水定容至500 mL容量瓶，充分定容混匀后分别量取1 mL，待测，考察料液比对方剂多糖提取率的影响。

2.2.2 提取时间对方剂多糖提取率的影响 精确称量准备试验方剂5 份，每份6 g，分别放置于5个锥形瓶中并加入150 mL蒸馏水，提取时间分别为1、1.5、2、2.5、3 h，80 ℃水浴提取，提取一次后过滤按照不同提取时间提取第二次，其余同2.2.1。考察提取时间对方剂多糖提取率的影响。

2.2.3 提取温度对方剂多糖提取率的影响 精确称量准备试验方剂5份，每份6 g，分别放置于5个锥形瓶中并加入150 mL蒸馏水，提取温度分别为60、70、80、90、100 ℃，按照不同提取温度分别水浴提取2 h，提取一次后过滤相同条件下进行二次提取，其余同2.2.1。考察提取温度对方剂多糖提取率的影响。

2.2.4 提取次数对方剂多糖提取率的影响 精确称量准备试验方剂3 份，每份6 g，分别放置于3个锥形瓶中并加入150 mL蒸馏水，提取次数按照1、2、3次，80 ℃水浴提取2 h，其余同2.2.1。考察不同提取次数对方剂多糖提取率的影响。

903 Feasibility of deep learning image-based segmentation algorithm in pathological section of gastric cancer

2.2.5 正交试验设计 根据文献报道并结合实际，在上述单因素试验的基础上，制定因素水平表，七味地藿颗粒多糖提取工艺的影响因素有提取温度、提取时间、料液比和提取次数，为此选择此4因素作为考察因素，并结合生产实际需要，每因素又选取3个水平，按照表1正交试验设计表安排实验，以多糖得率作为衡量多糖提取效率的双重客观指标，优选最佳工艺，为了提高统计分析的可靠性，每一条件下均进行重复试验(n=3)，测定结果取其平均值供统计分析用。正交试验因素与水平安排见表1。

表1 正交试验设计表Tab 1 Orthogonal test design table

3 结果与分析

3.1 分析标准曲线的建立 葡萄糖的标准曲线见图1。以葡萄糖的质量浓度x为横坐标，吸光度y(OD值)为纵坐标制作标准曲线，葡萄糖的线性回归方程为y=0.0064x+0.4037，R2=0.9992，葡萄糖标准溶液浓度为80～200 μg/mL范围时，线性关系良好。

图1 葡萄糖标准曲线Fig 1 Glucose standard curve

3.2 单因素对七味地藿颗粒多糖提取率的影响

3.2.1 料液比对方剂多糖提取率的影响 由图2可知，方剂中多糖提取率随料液比的增大而增大，即加水量越多，多糖的得率越大，多糖的提取率先呈快速上升，后上升平缓，料液比1∶25时方剂多糖提取率达到最大，往后随着料液比的增加而缓慢减少。因此最佳料液比选择1∶25。

图2 料液比对方剂多糖提取率的影响Fig 2 The effect of material liquid on the extraction rate of polysaccharide from the other agent

3.2.2 提取时间对方剂多糖提取率的影响 由图3可知，方剂中多糖提取率随提取时间的延长而增大，即提取时间越长，多糖的得率越大，多糖的提取率先呈快速上升，提取时间为2 h时方剂多糖提取率达到最大，往后随着提取时间的延长而缓慢减少。因此，最佳提取时间选择2 h。

3.2.3 提取温度对方剂多糖提取率的影响 由图4 可知，方剂中多糖提取率随提取温度的提高而增大，即提取温度越高，多糖的得率越大，多糖的提取率先呈快速上升，提取温度为90 ℃时方剂多糖提取率达到最大，往后随着提取温度的提高而缓慢减少。因此，最佳提取时间为90 ℃。

图3 提取时间对方剂多糖提取率的影响Fig 3 The effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide

图4 提取温度对方剂多糖提取率的影响Fig 4 The effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide

3.2.4 提取次数对方剂多糖提取率的影响 由图5可知，方剂中多糖提取率随提取次数的增多而增大，即提取次数越多，多糖的得率越大。提取1～2次时，有效成分浓度差大，提取率上升快；提取次数为3次时，与第2次提取相比浓度差小，提取率几乎并没提高趋于稳定。因此，最佳提取次数为3次。

图5 提取次数对方剂多糖提取率的影响Fig 5 The effect of extraction times on extraction rate of polysaccharide

3.3 七味地藿颗粒多糖提取工艺优化正交试验结果 七味地藿颗粒多糖提取工艺优化4因素3水平正交试验结果与分析见表2。

表2 正交试验结果与分析Tab 2 Results and analysis of orthogonal test

由表2可知，在4个主要因素中，由极差可以看出D>C>A>B，即提取次数的影响最大，提取温度次之，料液比第三，而提取时间的影响最小。

七味地藿颗粒多糖提取工艺优化4因素3水平正交试验结果方差与显著性分析见表3。

表3 方差与显著性分析Tab 3 Analysis of variance and significance

a.R2=0.994(调整R2=0.997);A料液比 B(误差)提取时间 C提取温度 D提取次数

由表2可知，提取时间对于多糖提取率的影响最小，故将B提取时间做为误差项，并对其他因素进行显著性分析，可得出P值D<0.05

4 讨论与结论

多糖是存在于生物体内的一类生物大分子物质，具有重要的生物活性[10-11]。多糖的传统提取方法为水浴煎煮、水提醇沉等方法。因此，试验采取水浴提取多糖，溶剂来源为蒸馏水，经济实惠且提取率高[12-13]。

研究表明，方剂多糖提取工艺的最优条件为：1∶25为最佳料液比，2 h为最佳提取时间，90 ℃为最佳提取温度，最佳提取次数为3次。另外，经正交试验结果方差与显著性分析发现，在影响方剂多糖提取率的主要因素中，以提取次数的影响最大，且相对于其他因素显著(P<0.05)，提取温度次之，料液比第三，而提取时间的影响最小，并通过正交试验得出最佳提取工艺为料液比为1∶25，提取时间为2 h，提取温度为90 ℃，提取次数为3次。

对于七味地藿颗粒中有效成分多糖的提取工艺进行优选，是从单味药有效成分的提取到组方有效成分的提取的进步，从而为临床应用中药方剂提供试验依据[14-15]。