n⁃3多不饱和脂肪酸对SKH⁃1小鼠皮肤急性光损伤模型的保护作用研究

徐雨婷 王佩茹 韩佳彤 王秀丽

200443上海，安徽医科大学上海皮肤病临床学院（徐雨婷）；上海市皮肤病医院同济大学医学院光医学研究所（王佩茹、韩佳彤、王秀丽）

紫外线照射可引起急性光损伤、光敏性皮肤病、免疫抑制、慢性光老化等［1⁃2］。膳食中n⁃3、n⁃6多不饱和脂肪酸（PUFA）是人体必需脂肪酸，其中n⁃3 PUFA在心血管系统、结肠肿瘤防治方面发挥保护作用［3］。白种人n⁃3 PUFA摄入和皮肤光老化呈负相关［4］。既往研究表明，膳食补充n⁃3 PUFA可减少炎症介质白细胞介素1β（IL⁃1β）、IL⁃6、肿瘤坏死因子α（TNF⁃α）等的产生，从而减轻炎症反应，调节免疫功能［5］。但是，膳食补充n⁃3 PUFA是否可以减轻紫外线引起的光损伤以及具体剂量尚不清楚。我们在紫外线诱导的SKH⁃1无毛小鼠急性光损伤模型上，评估n⁃3 PUFA摄入对皮肤光损伤的防护作用，确定有效剂量，初步探索作用机制。

材料与方法

一、主要仪器和试剂

SS⁃03AB型日光紫外线模拟器（UVA∶UVB=9∶1，上海希格玛高技术有限公司），兔抗鼠IL⁃1β、TNF⁃α多克隆抗体（英国abcam公司），兔抗鼠IL⁃6多克隆抗体（美国Proteintech公司），IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α DuosetELISA试剂盒（美国R&D systems公司），Heine手持式皮肤镜（Delta20，德国汉尼光学仪器公司）。

二、实验动物分组及处理

自美国JAKSON实验室引进5～6周龄健康雄性SKH⁃1无毛小鼠［实验动物许可证号：SCXK（沪）2015⁃0002］，体重25 g左右，上海市公共卫生中心动物中心负责繁育饲养于清洁级动物饲养室内，室温20～24℃。根据文献［6⁃7］，采用SS⁃03AB型日光紫外线模拟器在小鼠背部照射，最终确定小鼠背部皮肤紫外线最小红斑量（minimalerythema dose，MED）为500mJ/cm2。

将50只小鼠随机分为5组，每组10只。定制5种饲料（美国Dyets公司），n⁃3 PUFA占总脂肪酸的比例分别为0（对照组）、12.5%、25%、50%、100%，其余营养成分与正常实验小鼠饲料相同，分别喂养5组小鼠。喂养至第50天，用4mm环钻钻取小鼠背部皮肤组织2块，其中1块放入4%甲醛溶液中固定，制作组织病理切片并行免疫组化检查；另1块组织用于制备组织匀浆检测细胞因子。所有实验小鼠接受单次照射，剂量为2MED。

紫外线照射后24 h观察小鼠皮肤变化情况，留存大体照片和皮肤镜照片，并用4mm环钻取背部皮肤组织2块，保存及后续实验同照光前。

三、HE染色和晒伤细胞计数

组织标本HE染色，光镜下观察组织病理改变。两名未参与本实验的医生在100倍视野下于每张切片上随机选取10个不重叠视野，计数晒伤细胞（细胞体积变小、核固缩）［8］，计算每视野下晒伤细胞均值。

四、免疫组化SP法检测IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α表达

小鼠皮肤组织石蜡切片用兔抗鼠IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃6抗体行免疫组化SP法染色。用Image J图像分析系统计算阳性表达（棕黄色染色区域）面积百分比。阴性对照用0.1mmol/L磷酸盐缓冲液代替一抗染色。

五、ELISA检测组织中IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α含量

将组织匀浆低温离心（12 000 r/min，离心半径2 cm）15min，提取上清液100 μl，测定IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α含量，操作方法参照相关试剂盒说明书。

六、统计学方法

结 果

一、大体及皮肤镜观察结果

大体观察结果见图1。照光前小鼠皮肤正常，色泽均匀，未见任何损伤。紫外线照射后24 h，对照组、12.5%n⁃3 PUFA组小鼠背部出现红斑、明显水肿、脱屑、抓痕等晒伤反应；25%、50%n⁃3 PUFA组小鼠仅发现轻微红肿，无脱屑及搔抓痕迹；100%n⁃3 PUFA组的小鼠皮肤红肿不明显。皮肤镜观察显示，照光前小鼠皮肤可见皮纹、毛发、血管等正常结构，无特殊改变；紫外线照射后24 h，对照组小鼠皮肤可见明显抓痕、大量鳞屑；12.5%n⁃3 PUFA组小鼠皮肤可见轻微抓痕；其他组小鼠皮肤均未见抓痕、鳞屑。

二、组织学观察结果

见图2。照光前小鼠皮肤组织结构完整，表皮、真皮及皮下组织层次清晰，表皮厚薄均匀。紫外线照射后24 h，对照组、12.5%n⁃3 PUFA组小鼠表皮厚薄不均，细胞间水肿，炎细胞聚集，可见大量晒伤细胞；25%、50%n⁃3 PUFA组小鼠仅见轻微表皮增厚，晒伤细胞较少；而100%n⁃3 PUFA组小鼠表皮未见明显变化。见表1。

免疫组化结果显示，照光前小鼠皮肤组织内无明显炎症相关因子（IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α）表达。紫外线照射后24 h，小鼠表皮和真皮均不同程度表达IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α；且n⁃3 PUFA含量越高，炎症因子表达越少；对照组和12.5%n⁃3 PUFA组3种炎症因子表达水平均高于25%、50%、100%n⁃3 PUFA组，差异均有统计学意义（P＜0.001），见表1、图3。

三、皮肤组织匀浆中IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α含量

ELISA检测显示，照光前3种炎症因子含量极低，紫外线照射后24 h，各组小鼠炎症因子表达明显升高，且25%、50%和100%n⁃3 PUFA组小鼠皮肤组织中IL⁃1β含量低于对照组、12.5%n⁃3 PUFA组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。TNF⁃α和IL⁃6检测结果与IL⁃1β组间变化趋势类似。见表2。

讨 论

紫外线是致皮炎、光老化和皮肤癌变的主要环境因子之一［9］。紫外线照射皮肤可产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），使皮肤发生一系列光生物化学反应，引起皮肤急性光损伤［10］，临床上可表现为皮肤血管扩张、红斑、肿胀等；组织学改变包括细胞间水肿，毛细血管扩张，表皮出现“晒伤细胞”以及炎症细胞浸润等。从分子水平上看，在ROS刺激下，细胞中的各种磷脂酶活化，动员细胞膜上磷脂中花生四烯酸（AA，属于n⁃6 PUFA）或二十碳五烯酸（EPA，属于n⁃3 PUFA）等不饱和脂肪酸，在脂加氧酶（LOX）和环氧合酶（COX）作用下产生前列腺素（PG）、白三烯和血栓素A2等类二十烷酸，增加血管通透性、趋化中性粒细胞，从而调节IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α等炎症因子的产生［11⁃14］。

图1 紫外线照射前后5组小鼠皮肤表现 照光前小鼠皮肤正常。紫外线照射后24 h，对照组、12.5%n⁃3 PUFA组小鼠背部皮肤出现红斑、明显水肿、脱屑、抓痕等，25%、50%n⁃3 PUFA组小鼠仅发现轻微红肿，100%n⁃3 PUFA组小鼠皮肤红肿不明显

图2 紫外线照射前后5组小鼠皮肤组织病理改变（HE×100） 照光前小鼠背部皮肤组织结构完整，表皮厚薄均匀，表皮、真皮及皮下组织层次清晰。照光后对照组、12.5%n⁃3 PUFA组小鼠表皮厚薄不均，细胞间水肿（红色箭头），晒伤细胞（黄色箭头）、炎症细胞聚集（黑色箭头），25%和50%n⁃3 PUFA组可见轻微表皮增厚，晒伤细胞较少，100%n⁃3 PUFA组里未见明显结构改变

表1 紫外线照射后24 h小鼠皮肤中晒伤细胞数量及不同炎症细胞因子的表达（±s）

表1 紫外线照射后24 h小鼠皮肤中晒伤细胞数量及不同炎症细胞因子的表达（±s）

注：a与对照组和12.5%n⁃3 PUFA组比较，P＜0.05；b与同列25%、50%、100%n⁃3 PUFA组相比，差异均有统计学意义，P＜0.001。PUFA：多不饱和脂肪酸

组别对照组12.5%n⁃3 PUFA组25%n⁃3 PUFA组50%n⁃3PUFA组100%n⁃3 PUFA组F值P值只数10 10 10 10 10晒伤细胞（个/100倍视野）17.50±4.93 14.25±1.71 6.50±1.73a 4.75±2.06a 4.50±1.73a 19.1＜0.001白细胞介素1β（%）9.90±0.75b 4.05±0.50b 3.98±0.49 1.31±0.20 0.84±0.10 175.8＜0.000 1白细胞介素6（%）12.25±0.52b 3.61±0.79b 2.42±0.23 1.04±0.13 0.71±0.24 332.6＜0.000 1肿瘤坏死因子α（%）4.96±0.21b 4.06±0.27b 1.43±0.47 1.08±0.12 0.79±0.16 145.7＜0.000 1

表2 ELISA检测紫外线照射前后各组小鼠皮肤中炎症因子表达水平（±s，ng/L）

表2 ELISA检测紫外线照射前后各组小鼠皮肤中炎症因子表达水平（±s，ng/L）

注：a与同列25%、50%、100%n⁃3PUFA组相比，P ＜0.05。PUFA：多不饱和脂肪酸

照光前照光后组别 只数对照组12.5%n⁃3 PUFA组25%n⁃3PUFA组50%n⁃3 PUFA组100%n⁃3 PUFA组F值P值10 10 10 10 10白细胞介素1β 112.30±24.74 72.36±12.02 75.96±9.22 69.80±21.93 58.73±19.76 2.931＞0.05白细胞介素6 104.80±5.65 94.80±36.16 82.30±26.16 115.80±32.07 67.80±16.97 1.458＞0.05肿瘤坏死因子α 92.06±12.35 84.15±40.44 71.90±11.45 94.70±45.43 66.86±12.10 0.398＞0.05白细胞介素1β 1962.44±451.78a 1276.67±531.54a 862.52±102.08 746.39±28.76 312.11±39.35 11.670＜0.001白细胞介素6 396.30±70.00a 373.80±67.55a 271.80±52.74 264.80±10.54 222.30±14.85 5.262＜0.05肿瘤坏死因子α 492.33±27.30a 547.67±63.31a 308.15±36.96 272.00±51.64 297.00±47.68 21.830＜0.000 1

图3 紫外线照射前后不同炎症细胞因子在5组小鼠皮肤中的表达（免疫组化染色×100）

既往人体实验表明，膳食鱼油能显著增加免疫细胞膜磷脂中EPA、二十二碳六烯酸含量，使AA含量下降［15⁃16］，而且n⁃3 PUFA可通过与AA直接竞争，对脂加氧酶、环氧合酶作用或者影响酶活性来减少AA来源的PGE2和白三烯B4等类二十烷酸［17］，从而发挥抗炎作用。n⁃3 PUFA除了对系统性疾病如心血管疾病、结肠肿瘤等有一定防治作用，对皮肤最小红斑量、长期紫外线照射所致皮肤光老化亦有一定影响。有研究表明摄入来自鱼贝类等海洋来源的EPA、二十二碳六烯酸的受试者光老化程度较轻［4］。但是影响急性光损伤的具体剂量和保护作用之间的关系尚未见研究。

我们定制5种n⁃3 PUFA含量不同的小鼠饲料，分别喂养5组SKH⁃1无毛小鼠。该型小鼠皮肤裸露，同时又具有健全的免疫功能，类似于正常人体皮肤，便于紫外线照射和实验观察［7］。SS⁃03AB型日光紫外线模拟器发射的光线比较接近日光紫外线的组成，因此我们选择其作为照射光源。本课题组前期研究发现［18］，小鼠膳食摄入n⁃3 PUFA第2周皮肤中n⁃3 PUFA包括α-亚麻酸、EPA和二十二碳六烯酸的含量即可显著提高，但n⁃6 PUFA如AA、亚油酸的含量降低，这种变化在第4周趋于稳定。因而本研究在特殊喂养第50天进行急性光损伤造模，因1MED引起的小鼠皮肤红肿反应不强，故采用2MED造模。在紫外线照射24 h后大体和皮肤镜观察均显示对照组、12.5%n⁃3 PUFA组小鼠皮肤出现红斑、水肿、脱屑、抓痕等，组织病理观察到两组小鼠表皮厚薄不均、细胞间水肿，可见晒伤细胞、大量炎症细胞聚集等现象。该结果与胡坚等［7］研究结论相同，表明成功建立急性光损伤模型。25%、50%n⁃3 PUFA两组照光小鼠仅见轻微红肿、表皮增厚、细胞增生等，而100%n⁃3 PUFA组照光小鼠只观察到轻微红肿，且其表皮厚薄均匀，结构完整，层次清晰，与照光前小鼠的表现相似。表明n⁃3 PUFA对紫外线所致急性损伤有光保护作用。

本研究中免疫组化检测还发现，紫外线照射后，各组IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α在表皮或真皮中有不同程度表达；且随n⁃3 PUFA含量升高，组织内3种因子的表达基本呈下降趋势。ELISA检测发现，与对照组、12.5%n⁃3 PUFA两组相比，25%、50%、100%n⁃3 PUFA组IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α含量降低。结合25%、50%、100%n⁃3 PUFA组小鼠皮肤损伤程度较轻，提示n⁃3 PUFA可能通过抑制上述炎症因子产生，减轻急性光损伤。

以上结果表明，小鼠膳食中n⁃3 PUFA的比例达到25%时对紫外线所致的急性光损伤即可产生显著防护作用，而且，比例越高，防护效果越显著。这与一些研究证明饮食中n⁃6 PUFA/n⁃3 PUFA的比例不应超过4∶1结果一致［19］。但这些脂肪酸是否具有直接的紫外线防护作用尚需进一步研究。