黄连膏通过PI3K/AKT/eNos通路促进模型小鼠创面血管生成的实验研究＊

张晓芬，宋 静，李洪昌，陈亚峰，奉典旭＊＊

（1.河南中医药大学护理学院 郑州 450046；2.河南省柘城县人民医院护理部 柘城 476220；3.上海中医药大学附属普陀医院普外科 上海 200062）

黄连膏最早见于外科专著《刘涓子鬼遗方》，至清代《医宗金鉴》形成了用于中医外科治疗皮肤创面疾病的“经典”处方，由黄连、黄柏、生地黄、当归、姜黄五味药组成。其中黄连、黄柏清热解毒，利湿排脓；生地清热凉血养阴；当归、姜黄活血化瘀，袪腐生新，全方共奏清利湿热、活血化瘀，袪腐排脓生新的作用，主治湿热诸疮。黄连膏在临床应用广泛，疗效显著，本课题组在前期已经证实黄连膏能够增加成纤维细胞生成、提高TGF-β、胶原蛋白的蛋白含量而促进创面愈合[1]。但对于其治疗的作用机制，特别是在细胞、分子和基因的水平的实验研究还有待探讨，因此本研究从黄连膏治疗创面愈合的机理及其对小鼠创面血管生成的影响进行探寻，以其为临床运用黄连膏提供更充实的理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物及主要试剂与仪器

实验用生药材均购自中国上海同仁堂制药公司，上述药材质量标准参照2005年版《中华人民共和国药典》一部；麻油购自河南南阳和润粮油有限公司。药材黄连18 g、黄柏18 g、生地黄60 g、当归30 g、姜黄18 g浸入720 g麻油中浸泡72小时，将麻油及药入铁锅内，文火使药料炸至表面呈深褐色，中部焦黄为度，在无菌操作台滤去药渣，待温度降至适宜90℃时，再将50 g蜂蜡加入其中，文火徐徐收膏、装瓶，常温保存备用。基质膏配置方法同上，主要成分为麻油和蜂蜡（按麻油、蜂蜡72∶5配置）。CD-31兔来源多克隆抗体购自英国Abcam公司，Alexa flour 488标记的羊抗兔二抗、pAKTs308、pAKTs437、AKT兔来源单克隆抗体均购自购自美国CST公司，兔多克隆抗体VEGF-A，兔单克隆抗体eNOS购自英国Abcam公司。辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗购自碧云天生物技术有限公司。Real time RCR扩增仪Vii ATM7型购自美国ABI公司，超净工作台购自中国Haier公司；荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 动物及分组处理

C57BL/6J雄性健康无特殊病原体级小鼠45只，8-10周龄，体重20～25 g，由上海斯莱克实验动物有限公司（生产许可证号SCXK（沪）2012-0002）提供，饲于上海中医药大学附属普陀临床医学院动物房（动物实验室许可证号为SYXK（沪）2013-0055）。混合饲料单笼饲养，自然光照射，室温控制在20℃左右。本次实验动物征得上海中医药大学附属普陀临床医学院动物伦理委员会同意。实验性小鼠适应性饲养l周后，按Asai J等[2]的方法，用8%硫化钠脱去后背部区域的毛发，温水清洗拭干。褪毛l天后小鼠行2.5%戊巴比妥钠按公斤体重40 mg/kg腹腔内注射，麻醉成功后，5%的碘酒及75%的酒精局部消毒术区，在小鼠后背部正中用角膜环钻剪去一块直径为7.5 mm的圆形，全层切除皮肤，开放创面，充分止血。待清醒后单笼饲养，按完全随机数字表法随机分组，分为基质组15只；黄连膏组15只，空白对照组15只分别做好组间标记。创伤模型制成后，从第1天开始局部用药治疗，每次换药时创面先用碘伏局部消毒清洗后，分别外敷给药，以填充满创面为准，黄连膏组小鼠的创面外敷黄连膏，基质组创面外敷基质膏，空白对照组15只用碘伏局部消毒清洗不敷任何药物，每日两次，分别于上午8:00时和下午8:00时各换药1次。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 创面观察及愈合率测定

于造模后第0、3、7、10、14天，观察创面大体情况并用数码相机拍照，将创面图像资料输入高分辨率计算机，跟踪创面边缘并计算出创面区域。用医疗专用图分析软件Image J予以分析，取得面积数据，计算出创面愈合率[3]。创面闭合的百分率使用下列方程计算：

创面愈合率=（原始创面面积一残余创面面积）/原始创面面积×l00%

1.3.2 免疫组织荧光观察

切片常规脱蜡和水化，组织抗原修复，血清封闭，滴加兔多克隆CD-31一抗（稀释比均为1∶200），4℃孵育过夜；第二天取出爬片，洗去一抗反应液，PBS冲洗3次，滴加单克隆Alexa flour 488标记的羊抗兔二抗（稀释比均为1∶1 000），避光孵育30 min，进行DAPI核染，每张爬片滴加20 uL抗荧光淬灭封片液，轻覆上盖玻片，显微镜下观察并采集图片，图像输入计算机中，应用图像分析软件Image J计算阳性染色区域荧光的强度并量化。

1.3.3 bFGF和PDGF的mRNA水平的检测

RT-PCR用来检测不同治疗组在不同的时间（3天、7天、14天）bFGF和PDGF的mRNA水平变化。取创面组织，在液氮冷冻环境下研磨，加TRIzol 1 ml，照说明书提取总RNA,反转录为cDNA，常规PCR扩增，扩增条件为95℃预变性4 min，95℃变性20 s，55℃退火20 s，75℃延伸50 s，45个循环，75℃再延伸8 min。mRNA水平分析采用ΔΔCt方法，引物序列信息由上海华大分子生物技术研究所合成。

1.3.4 AKT、VEGF-A、eNos的蛋白表达

采用蛋白质印迹法检测。2组各取冻存创面组织0.1 g，加组织裂解液匀浆，提取蛋白并定量。蛋白样本均以50 μg上样，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电脉，湿法转至聚偏二氟乙烯膜上，50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h。分别加入兔单克隆AKT（稀释比均为1∶ 2 000）、pAKTs308、pAKTs437、兔单克隆抗体eNOS一抗、兔多克隆抗体VEGF-A（稀释比均为1∶1 000），4℃孵育过夜。加入山羊抗兔IgG二抗（稀释比为1∶ 5 000），室温1小时振荡孵育，化学发光、显影，凝胶图像分析系统行灰度扫描分析，系统自带软件分析蛋白条带灰度值。以GAPDH为内参照，结果以AKT、VEGF、eNos与GAPDH灰度值的比值表示。本实验重复3次。

1.4 统计学处理

本组数据采用SPSS 21软件包进行处理，计量资料用均数±标准差（x-±S）表示，对CD31计数、bFGF和PDGF的mRNA水平等计量指标多组均数的比较采用单因素方差分析，两两比较行Tukey检验，对不同时间创面愈合率的比较采用重复测量资料的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 创面大体观察及愈合率

伤后0 d，3组小鼠创面均红肿；伤后3 d，3组小鼠创面痂皮薄、面积较大，无红肿，基质组小鼠伴有轻度渗出；伤后7 d，3组小鼠创面均干燥，结痂无红肿、渗出。伤后10 d，3组小鼠创面面积明显缩小，黄连膏组小鼠创面痂皮部分脱落；基质组小鼠创面痂皮变厚，部分脱落，创面缩小面积小于同时相点黄连膏组。空白对照组创面痂皮变厚，无脱落，伤后14 d，黄连膏组小鼠大部分创面愈合，创缘周边较多被毛覆盖；基质组和空白对照组小鼠创面尚未完全愈合，创缘周边较少被毛覆盖。见图1。

表1 引物序列表

伤后3、7 d小鼠创面愈合率，黄连膏组、基质组、空白组对照组相近（P值均大于0.05）；伤后10、14 d，黄连膏组小鼠创面愈合率显著高于基质组和空白对照组（P值均小于0.01）。3组小鼠伤后7、10、14 d创面愈合率均显著高于组内前一时相点（P值均小于0.01）。见表2。

2.2 对小鼠创面组织CD-31形成的影响

CD-31是血管内皮细胞标记物，因此我们选用CD-31免疫荧光来标记各组小鼠第3、7天创面组织血管生成的影响。结果显示黄连膏组伤后3 d创面组织中CD-31阳性细胞百分率明显高于基质组和空白对照组（P＜0.05），伤后7 d，黄连膏组创面组织中CD-31阳性细胞百分率明显高于基质组和空白对照组（P＜0.01）；伤后3、7 d基质组和空白对照组创面组织中CD-31阳性细胞百分率无差异（P＞0.05）；3小鼠伤后3、7 d创面组织中CD-31阳性细胞百分率显著高于组内前一时相点（P＜0.01或P＜0.05）。见表3。

图1 3组全层皮肤缺损小鼠各时相点创面大体情况

2.3对小鼠创面组织bFGF和PDGFmRAN水平的影响

表2 3组全层皮肤缺损小鼠伤后各时相点创面愈合率比较（%，±S）

表2 3组全层皮肤缺损小鼠伤后各时相点创面愈合率比较（%，±S）

注：处理因素主效应，F=6.76，P＜0.05；时间因素主效应，F=579.95，P＜0.01；两者交互作用，F=12.08，P＜0.01；t值、P值为组间同时相点比较所得，t1值、P1值为黄连膏组与基质组相比较；t2值、P2值为黄连膏组与空白组相比较；t3值、P3值基质组与空白对照组相比较；F值、P值为组内各时相点总体比较所得；与组内前一时相点比较，aP＜0.01。

?

图2 小鼠创面组织CD-31阳性细胞（第7天，免疫荧光图×400），绿色荧光代表CD-31阳性细胞

表3 局部应用黄连膏对小鼠创面CD-31阳性细胞数的影响

伤后3、7 d，黄连膏组小鼠创面组织中bFGF的mRAN水平明显高于基质组和空白对照组（P值均小于0.01）；伤后14 d，基质组和空白对照组小鼠创面组织中bFGF的mRAN水平达到最高，明显高于黄连膏组（P＜0.05）。黄连膏组小鼠伤后7 d创面组织中bFGF的mRAN水平均显著高于组内前一时相点（P＜0.01），伤后14 d黄连膏组bFGF的mRAN水平低于组内前一时相点（P＜0.01），基质组和空白对照组，伤后3、7、14 d创面组织中bFGF的mRAN水平均显著高于组内前一时相点。伤后3、7 d，黄连膏组小鼠创面组织中PDGF的mRAN水平明显高于基质组和空白对照组（P＜0.01或P＜0.05）；3组小鼠伤后3、7 d创面组织中PDGF mRAN水平均显著高于组内前一时相点（P＜0.01）。伤后14 d，3组小鼠创面组织中PDGF mRAN水平无明显差异（P＞0.05），见表4和表5。

2.4 对AKT、VEGF-A、eNos的蛋白表达影响

结果显示黄连膏组伤后7d创面组织中P-AKTS308和P-AKTS437明显高于基质组和空白对照组（P＜0.05或P＜0.01），VEGF-A和eNOS的蛋白含量也明显高于基质组和空白对照组（P＜0.05或P＜0.01）。见表6及图3。

表43 组小鼠各时相点创面组织中bFGFmRNA水平比较（x-±S）

表53 组小鼠各时相点创面组织中PDGFmRNA水平比较（x-±S）

表6 黄连膏对小鼠创面伤后7d创面组织中AKT、VEGF-A、eNos的蛋白表达影响

3 讨论

修复创面的肉芽组织中含有大量的新生血管，为创面组织的生成提供充分的氧气和营养物质，因此血管的生成是组织修复的前提和基础，是创面修复过程中的重要环节。其中VEGF-A、PDGF和bFGF是最重要的促进血管生成的因子。VEGF是血管内皮细胞特定的有丝分裂原，通过促进血管内皮细胞迁移和增殖参与支持早期血管生成，对血管生成起着非常重要的促进作用。据报道[4]从当归和川芎提取物可影响心肌梗死大鼠VEGF的表达，促进血管内皮细胞增殖，提高鸡胚绒毛膜尿囊模型毛细血管的数量。同样，据研究[5]当归的水提物可以提高人脐静脉内皮细胞增殖、迁移、入侵和在人工基底膜基质的血管形成以及通过增强VEGF表达和刺激p38磷酸化作用促进斑马鱼体内血管生成。同时有报道[6]生地可以通过提高VEGF-A的表达，促进糖尿病大鼠创面血管生成。最近的研究报告指出，生地黄具有促进创面血管生成，增强VEGF的表达[7-8]。在我们的实验中发现，黄连膏治疗组创面在第3、7天VEGF-A的mRNA表达明显高于基质组。CD 31是创面微血管组织中血管内皮细胞增殖的标记物，因此我们同时采用免疫荧光检测了各组创面CD31阳性表达率，结果表明，第3、7天小鼠创面组织，发现黄连膏组免疫荧光强度明显高于基质组和空白对照组，可见黄连膏中药能明显促进小鼠创面组织的血管生成。

图3 蛋白质印迹法检测伤后7天3组小鼠AKT、VEGF-A、eNos的蛋白表达

PI3K是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，其激活后通过与Akt结合，促进Akt磷酸化，AKT（也称为蛋白激酶B，PKB）是PI3K下游信号通路中最为重要的一个蛋白，其激活需要其2个重要的位点发生磷酸化，分别是位于激活结构域的thr308位点和Ser473位点。激活的AKT从细胞膜转移到细胞质和细胞膜，通过磷酸化作用磷酸化激活生成NO（nitric oxide，NO）的关键限速酶eNOS（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），从而调控创面血管生成[9,10]。NO通过促进内皮细胞迁移、增殖和存活在血管生成过程中起着至关重要的作用[11]。据报道[12]姜黄素能够使内皮祖细胞的eNOS基因表达上调从而促进了NO分泌，促进血管生成。本研究亦显示，黄连膏治疗组伤后7d创面组织eNOS的蛋白含量也明显高于基质组和空白对照组，并且磷酸化的AKTS308和AKTS437两个位点蛋白含量明显高于基质组。

由此可见黄连膏外用可以促进全层皮肤切除小鼠创面的愈合速度，促进创面毛细血管的生成，可能通过调节PI3K/AKT/eNOS信号通路促进AKTS308和AKTS437两个位点磷酸化，调节eNOS、VEGF-A的蛋白表达，促进PDGF和bFGF的生成有关。

中药治疗疾病特点是多靶点、多渠道发挥作用，未来还应进一步的从创面愈合的其它方面，如黄连膏与表皮上皮化、与其它生长因子、及分子、细胞方面探讨黄连膏对创面的愈合作用。