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(河北中医学院药学院, 石家庄 050200)
酸枣种子即酸枣仁为鼠李科植物酸枣[ZiziphusjujubaMill.var.spinose(Bunge) Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟种子[1]。其味酸、甘,性平,归肝、心、胆经,具有养心安神等作用,有较高的药用价值和经济价值[2]。主产于河北、山东、辽宁、陕西、河南等省。秋末冬初采收成熟果实,除去果肉和核壳,收集种子,晒干。目前酸枣仁在治疗失眠等疾病使用量骤增,对酸枣仁的质量要求更高,但市场上酸枣仁因产地、栽培、管理方法等因素不同导致其质量参差不齐,因此,研究酸枣种子萌发条件,筛选优质种苗具有一定的现实意义。
本试验采用显微镜观察酸枣种子不同萌发阶段的石蜡切片,采用体式显微镜观察酸枣种子发芽前、后的形态特征;并通过三因素三水平正交试验探究赤霉素浓度、温度和光照时间对酸枣种子发芽的影响,为酸枣的种植栽培提供参考。
光照培养箱(MGC-450 BP上海一恒科学仪器有限公司);SZ 61型变焦体式显微镜、CX 41型显微镜(日本OLYMPUS公司);SQP型万分之一电子天平(德国SARTORIUS公司);Milli-Q超纯水机(美国THERMO公司)。
实验所用的酸枣种子(河北邢州枣业有限公司提供),经河北省中药鉴定专家孙宝惠教授鉴定为为鼠李科植物酸枣[ZiziphusjujubaMill.var.spinose(Bunge) Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟种子。种子的百粒重为4.458 5 g,含水量为8.90%,种子吸水率为22.45%。TTC染色率为97.67%。
赤霉素(GA3)购于上海阿拉丁生化科技有限公司,水为自制纯水。
发芽纸为2层经过消毒的滤纸。
1.3.1 试验方法
试验前对所采集到的种子按样品编号进行扦样和净度分析后,从每份样品中分别取出25粒干净种子充分混匀,用于种子的发芽试验。
取纯净的混合酸枣仁种子,经浸种吸胀后,置纸上发芽床培养皿,每皿25粒,3次重复,在设定温度的培养箱中进行培养。每日观察记录酸枣仁种子发芽状态,保持培养皿温度。发芽计数时间的设定根据适宜发芽条件下的发芽表现,确定初次计数和末次计数时间。以达到50%发芽率的天数为初次计数时间,以发芽率达到最高时,以后再无萌发种子出现时的天数为末次计数时间。发芽率以最终达到的正常幼苗百分率计。即:
发芽率(%)=发芽种子数/供试种子总数×100%;
酸枣种子没有休眠期,其干燥成熟种子于20 ℃,湿度90%,光照强度8 000 lx条件下,5~7 d即可萌发。种子萌发时首先可见胚根发育成的白色的根从种子发芽孔出萌出。随后酸枣种子红褐色的皮逐渐脱落,2片绿色的子叶逐渐伸展,为种子萌发提供营养。
1.3.2 试验设计
采用Box-Behnken响应面法进行试验设计[3],以酸枣仁种子发芽率(Y),选择赤霉素浓度(A)、温度(B)、光照时间(C)这3个因素,设计三因素三水平的中心组合,并采用Design-Expert 8.0.6 Trial软件进行设计与分析,因素水平见表1。
表1 因素水平
因素水平-101赤霉素浓度(mg/L)200500800温度(℃)202530光照时间(h)81624
1.3.3 种子萌发过程解剖结构观察
酸枣种子在30 ℃的条件下,5 d左右即可萌发,本实验采用体式显微镜观察并对比酸枣种子萌发前后的形态特征。采用显微镜观察放大不同倍数的酸枣种子胚的形成与发育的石蜡切片,了解酸枣种子胚的发育过程。
石蜡切片的制作:1) 选取4个不同发育时期的酸枣种子,并加入FAA固定液(70%乙醇、冰醋酸、甲醛体积比为18∶1∶1),放置于4 ℃的冰箱中,固定24 h以上。2) 将浸泡好的切片经过脱水、透明、浸蜡、包埋处理后,使用轮转式切片机切片,切片完成后在50 ℃恒温水浴箱上进行展片。3) 依次用梯度浓度的二甲苯、无水乙醇、蒸馏水对切片进行脱蜡处理,并对酸枣种子切片进行番红-固绿染色剂染色。4) 切片染色后,进行透明、封片、烘片处理,在显微镜下观察和照相。
2.1.1 赤霉素浓度对种子萌发的影响[4]
在相同天数下,固定光照时间16 h和温度25 ℃,选择不同赤霉素浓度(0,200,500,800 mg/L)对酸枣种子萌发实验影响,结果见表2。赤霉素浓度为0 mg/L时,酸枣种子的发芽率为28%,随着赤霉素浓度的升高,酸枣种子的发芽率随之增加,其最适浓度为500 mg/L。超过500 mg/L时,赤霉素将抑制种子萌发。
表2 赤霉素浓度对酸枣种子发芽率的影响
赤霉素浓度(mg/L)0200500800发芽率(%)283665.3354.67
2.1.2 温度对种子萌发的影响
在相同天数下,固定光照时间16 h和赤霉素浓度500 mg/L,选择不同温度(15,20,25,30 ℃)对酸枣种子萌发实验影响,结果见表3。温度为15 ℃时,酸枣种子的发芽率为23%,随着温度的升高,酸枣种子的发芽率随之增加,30 ℃时,种子发芽率可达98.6%,温度继续增加则会抑制种子萌发,甚至会由于温度过高导致种子死亡。
表3 温度对酸枣种子发芽率的影响
温度(℃)1520253035发芽率(%)21.335665.3382.6753.33
2.1.3 光照时间对种子萌发的影响
在相同天数下,固定温度25 ℃和赤霉素浓度500 mg/L,选择不同光照时间(光照8 h/黑暗16 h、光照16 h/黑暗8 h、全光照)对酸枣种子萌发实验影响,结果见表4。实验结果表明,随着光照时间延长,酸枣种子发芽率明显增加。
表6 方差分析
平方和自由度均方F值p值显著性模型2198.929244.3213.69<0.0001**A5.8515.853.130.1203B373.601373.60199.84<0.0001**C353.381353.38189.03<0.0001**AB196.141196.14104.92<0.0001**AC65.37165.3734.970.0006**BC113.851113.8560.900.0001**A21007.8011007.80539.07<0.0001**B2115.461115.4664.760.0001**C23.1213.121.670.2371残差13.0971.87失拟项10.6333.545.780.0617纯误差2.4540.61总和2212.0016R2=0.9941;R2Adj=0.9865
注:“*”表示差异显著(p<0.05),“**”表示差异极显著(p<0.01)。
图1 各因素交互作用对酸枣种子发芽率的影响
表4 光照时间对酸枣种子发芽率的影响
光照时间(h)81624发芽率(%)42.6765.3372
利用Design-Expert 8.0.6 Trial软件的Box-Behnken设计,以赤霉素浓度、温度、光照时间为响应变量,发芽率为响应值,进行响应面试验,结果如表5所示,对表5数据进行多元二次回归拟合,建立提取工艺参数回归模型[5]。回归方程为:Y=65.9-0.85A+6.83B+6.65C-7.00AB-4.04AC-5.34BC-15.47A2+5.24B2-0.86C2。
对于所得的回归方程进行的分析和检验结果如表6所示。从表6可知试验模型p<0.05,说明所选的模型显著。失拟项p为0.061 7>0.05,即失拟项差异不显著,表明该二次回归模型能够显著拟合赤霉素浓度、温度、光照时间对于酸枣仁发芽率的影响。回归方程各项方差分析中F检验可以判断自变量对因变量的影响,一次项B、C对发芽率的影响达到极显著水平(p<0.01);模型中的二次项AB、AC、BC、A2、B2对发芽率的影响达到极显著水平(p<0.01)。
表5 实验设计和结果
ABC发芽率(%)100065.33211053.333-10162.67400065.335-1-1044.00610154.50700065.338-11070.679-10-140.001000066.671101180.001201-178.67131-1054.67140-1176.001510-148.00160-1-153.331700066.67
注:A为未萌发的酸枣种子;B为萌发的酸枣种子。图2 酸枣种子萌发
注:(a 1-a 4横切片2.0×;b 1-b 4纵切片2.0×;c 1-c 4横切片10.0×;d 1-d 4纵切片10.0×)①胚根;②胚轴;③胚芽;④子叶;⑤胚乳图3 酸枣种子萌发过程切片
采用Design-Expert 8.0.6 Trial软件分析酸枣仁发芽率实验中各因素两两交互作用对酸枣仁发芽率的影响绘制响应面图,如图1所示。图中两因素交互作用,响应面越陡峭,对发芽率的影响越大,反之则对发芽率的影响越小。图1 A和图1 B中,响应面坡度陡峭,表明赤霉素浓度与光照时间、温度的交互作用影响酸枣仁发芽率较强。图1 C中,响应面坡度平缓,表明光照时间与温度对于酸枣仁发芽率的交互影响相对较弱。 这与方差分析的结果基本保持一致。根据模型预测,酸枣仁发芽率的最大值为80.20%,最佳试验条件为:赤霉素浓度480 mg/L、温度30 ℃、光照时间24 h。
成熟的酸枣种子呈扁圆形或扁椭圆形,长5~9 cm,宽5~7 cm,厚约3 mm,表面紫红色或紫褐色,平滑有光泽,中间有1条隆起的总线纹。一端凹陷,可见线形种脐;另端有细小突起的合点。种子发芽时,白色的胚根从合点长出,一段时间后形成根,如图2所示。
通过观察不同生长发育时期的酸枣种子的横切片与纵切片可以发现酸枣种子由种皮、胚和胚乳3个部分构成,如图3所示。种皮由外种皮与内种皮构成,内种皮紧贴胚乳。胚占据种子体积约4/5,由胚芽、胚轴、胚根、子叶四部分构成[6]。其中子叶2片呈卵圆形,大小相等,相互对称,如图3(c-3)所示;胚芽着生于2片子叶中间的凹陷部位,胚芽原基略微突起,如图3(c-4)所示;胚轴连接着胚芽与胚根,同时与子叶相连,如图3(d-4)所示;胚根由染色较深的分生细胞构成,呈近椭圆形,如图3(d-2)所示。胚乳占据种子体积约1/5,内含淀粉粒等提供营养的物质,如图3(a-4)所示。
酸枣种子在赤霉素浓度480 mg/L、温度30 ℃、光照时间24 h的环境下发芽率最佳。在酸枣种子的胚中,胚根部分的细胞通过吸收子叶与胚乳提供的营养率先发育,伸长生长,突破种皮以吸收充足的水分。胚轴与胚芽处的细胞同时也进行着缓慢的分裂与分化。在种子生长发育的过程中,明显可见子叶与胚乳的萎缩,即能量的消耗。最终胚根发育成酸枣的根,胚轴发育成酸枣的根茎连接处,胚芽则发育成酸枣的茎、叶等器官。
赤霉素浓度、温度和光照时间3种因素共同影响酸枣种子的发芽。赤霉素浓度较低时,可促使酸枣种子的发芽率提高;当浓度较高时,则会抑制酸枣种子萌发[7]。所以选择合适的赤霉素浓度至关重要。温度对发芽率影响也较大,过高的温度会增强酸枣种子的呼吸作用,种子中储藏的营养物质被大量消耗,导致发芽率下降。故选择合适的温度也是酸枣种子萌发的关键[8]。光照条件对于某些寄生植物的初生吸器的分化形成产生方向性的引导作用[9]。但对于酸枣种子的萌发影响并不明显。本实验中,赤霉素浓度、温度、光照时间均对酸枣种子发芽率产生较大影响。但由于全天候的光照条件在室外环境下较难实现,所以在育苗时可适当延长光照时间。