组蛋白去乙酰化酶抑制剂对食管癌细胞抗肿瘤活性及其相关机制的研究进展

吴 健，王晶晶综述，杨鲸蓉，曾志勇审校

0 引 言

食管癌是全世界高发的恶性肿瘤之一,近20年食管癌的发生率增加了50%[1]。在我国，食管癌发病率居各类恶性肿瘤第五位，我国食管癌的发病人数及死亡人数均超出世界50%以上[2]。就目前而言，主流的食管癌治疗方式有如下几类，分别为：化学治疗、放射治疗、外科治疗、综合治疗。食管癌患者即使经过综合治疗，术后5年生存率仍小于30%。食管癌术后高复发率及高死亡率给食管癌的治疗带来了挑战。食管癌发病过程的机制至今未阐明，故寻找食管治疗新靶点提高疗效、减少复发是亟待解决的难题。在表观遗传学理论的基础之上，发现了一类新型靶向抗肿瘤药物，即组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)，其治疗肿瘤效果良好,能够为食管癌的研究和治疗提供新的思路。

1 HDAC抑制剂

表观遗传学是不涉及DNA序列改变的可遗传的基因表达变化研究，主要是从蛋白质、染色质和RNA等多个水平调控基因表达[3]。在食管癌肿瘤的发生发展全过程中，HDAC其抑制剂起到了关键的调控作用[4-5]。以乙酰化、磷酸化、甲基化修饰等为代表的组蛋白的共价修饰作用，往往会对基因的表达调控产生重要影响。已有研究结果显示，甲基化、乙酰化在食管癌的发生和发展中具有重要的作用[6]。组蛋白乙酰化及去乙酰化修饰是基因表达调控最主要的驱动力之一，组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase，HATs)和HDACs发挥了联合催化作用，进而对染色质各区域核心组蛋白的乙酰化程度起到了决定性的作用，直接关乎基因转录活化以及转录抑制间是否能够保持平衡状态。多项研究结果显示，在肿瘤发生与演进过程中，HATs/HDACs调节的失衡经常扮演了一个关键的角色。 HDACs对肿瘤发生于发展的促进途径是多样化的，分别能从基因转录调控、分化凋亡、信号转到等渠道发挥作用[7-8]。HDAC蛋白的表达以及活性会在HDACi的作用下被抑制，在这一过程中，组蛋白会迅速恢复乙酰化状态，与此同时，HAT的催化作用会有所增强，有助于抑制肿瘤细胞的存活[9]。

目前所有HDACi按照化学结构可分为4大类:以MGCD0103、MS-275等为代表的苯酰胺类、以TSA、PXD-101、SAHA等为代表的异羟肟酸类、以丁酸钠、丙戊酸等为代表的羧酸类、以Trapoxin、Acidipin、FK-228等为代表的环肽类。选择性HDAC抑制剂与广谱HDAC抑制剂是以对HDAC的特异性为标准所划分出的两种抑制剂类型，后者又可以细分为I类HDAC选择性及II类HDAC选择性这两种类型。大部分异羟肟酸类HDACI均会对I类、II类HDAC产生广谱抑制作用，而Tubacin则会对HDAC6产生特异性抑制；MS-275对I类HDAC及HDAC9具备选择性等[10-13]。

2 HDACis抗肿瘤机制

2．1HADCi诱导肿瘤细胞凋亡HDACi对肿瘤细胞凋亡的诱导作用在诱导肿瘤细胞凋亡体内与体外的实验研究中均得到了证实，HDACi诱导细胞凋亡的途径有分多种，目前研究比较明确的有外源性途径、内源性途径、活性氧产生与激活的调控途径。诱导外源性凋亡的途径即上调死亡受体、提高受体通路以及耐受性，进而调控相关蛋白的合成与表达。最主要可以诱导死亡受体5表达，此时HDACi与死亡受体将产生协同作用，通过激活easpase3、easpase9、easpase10，促使肿瘤细胞凋亡。这也是HDACi对肿瘤细胞选择性杀伤作用的机制之一[14]。诱导内源性凋亡的途径亦被称作线粒体途径，主要依靠以线粒体/细胞色素c介导的的凋亡途径来激活caspase，进而诱导肿瘤细胞凋亡[15]。调控与凋亡相关的蛋白HDACi能够诱导细胞凋亡，主要依靠对家族蛋白中的促凋亡担保、抗凋亡蛋白的上调或下调作用来实现，进而使多条信号转导通路活化，诱导细胞凋亡。但受肿瘤细胞中促凋亡蛋白以及抗凋亡蛋白基础水平差异的影响，HDACi增强促凋亡蛋白与降低抗凋亡蛋白作用往往也会有所不同。

2．2HADCi诱导肿瘤细胞周期停滞细胞周期调控异常是肿瘤发生的重要机制。HDACi可以通过调节细胞周期蛋白和细胞周期蛋白激酶抑制物的表达，诱导肿瘤细胞发生G1和/或G2期停滞。尽管不同类HDACi的化学结构存在较大差异，但基因调控模式却十分相似。HDACi诱导激活CDKN1A基因最常见。CDKN1A编码p21cipl，p21可以抑制CDK2和CDK4/6的活性，使去磷酸化Rb水平升高，抑制转录因子E2F所调控基因的激活，使细胞周期停滞于G1期。此外，HDACi可使多种细胞发生G2期停滞，这可能是因为HDACi特异性抑制cyclinD1启动子组蛋白H4的乙酰化水平，抑制G2期cyclinD1的转录和表达[16]。

2．3HADCi促进肿瘤细胞分化诱导细胞发生分化从定义上来讲，诱导细胞分化的核心在于发挥诱导分化剂的作用，诱导肿瘤细胞的分化途径，使其接近于正常细胞的生长方式或生长速度等，尽可能的诱使其朝着正常细胞转变。诱导肿瘤细胞分化的特点在于诱导肿瘤细胞向高分化的方向转变，而不是单纯的杀伤肿瘤细胞[17]。由此可见，这种治疗方式更为安全，对患者的损伤更小。就现阶段而言，此项技术在肿瘤治疗领域已经得到了认可与应用。

2．4HADCi抑制肿瘤细胞血管的生成HDACi对肿瘤习惯生成的抑制作用主要依靠对肿瘤细胞中的低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)与血管内皮因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受体降解的抑制来发挥作用[18]。相关研究表明，无论在生物体内还是体外，FK228均会对血管的生成产生强抑制作用。以未处理的细胞作为空白对照，对比FK228 处理24 h的Hela细胞，处理过的细胞中的VEGF 受体、FLT等表达严重受滞，且这些因子大多为刺激血管生成的因子。与此同时，以pVHL、NF等为代表的抑制血管生成因子则被诱导表达[19]。因此，在许多文献中都将HDACi列为一种新型抗肿瘤药物，集中阐释了其对HDAC的抑制作用，强调了其在抗肿瘤血管生成、肿瘤细胞诱导凋亡等方面的特性。

3 HDACis抗肿瘤优势

相比于其他抗肿瘤药物，HDACis的优势是显而易见的，突出体现在如下几个方面：首先，HDACis会在不显著危害正常组织细胞的同时对肿瘤细胞产生生长抑制或放射增敏作用。就目前而言，已经逐步开启了HDACis抗肿瘤治疗的临床一期以及二期研究。以LAQ824、pyroxamide、MS-275、SA-HA等为代表的新型HDACis的发现，有望为肿瘤治疗带来新的希望。随着此领域研究工作的不断深入，新的HDACis对于肿瘤疾病的治疗价值已经得到广泛认可，相关临床实验工作也在有序展开。其次，HDACis既能够单独作为抗癌药物而使用，还能够与其他抗癌药物或放疗联用，达到协同增效的作用。HDACis与全反式维甲酸联合应用于急性早幼粒细胞白血病的治疗，取得了良好的临床效果。此外，组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够对膀胱肿瘤有一定的抗癌效应，其不仅表现在能够阻滞膀胱肿瘤细胞周期和诱导细胞凋亡，而且还能够提高顺铂对顺铂耐药的人膀胱癌细胞的协同抗肿瘤作用。主要机制表现为阻滞细胞周期与激活凋亡基因[20]。另外，目前医学界也就去乙酰化化酶抑制剂苯甲酰胺CI-994与传统抗癌药吉西他滨的联用展开了临床试验，并取得了理想的预期效果。随着对肿瘤发生机制及HDACis构效关系地深入研究，HDACis的设计开发对肿瘤的治疗产生重要意义。

4 HDACis与食管癌的关系

目前HDACis在食管癌中的应用尚处于起步阶段，国内外其相关的研究并不多。Murakami等[21]研究了一种新型的HDAC抑制剂CHAP31，可诱导caspase9的裂解和上调Bax/Bcl-2比率，从而诱导食管癌细胞凋亡。Furutani等[22]应用新型HDAC抑制剂OBP-801/YM753可抑制氟尿嘧啶诱导的胸苷酸合成酶的表达，增强食管癌细胞对氟尿嘧啶和放疗的敏感性。Tzao等[23]在体外及小鼠肿瘤模型中应用HDAC抑制剂SAHA可诱导食管癌细胞E-cadherin的表达，抑制食管癌细胞迁移，侵袭和细胞外基质黏附。

近年的研究发现HDACs在食管癌的发生和发展中具有一定作用。Toh等[24]研究表明食管癌细胞的组蛋白H4在肿瘤侵袭的早期阶段显著增加了高乙酰化，此后，根据肿瘤进展程度，转化为低乙酰化。若食管癌患者的癌细胞低表达HDAC1，那么其会面临着较高的癌细胞侵犯食道壁深层的风险。Langer等[25]发现HDAC2高表达与食管腺癌的肿瘤侵袭性相关。这提示HDAC2与肿瘤的分化、增殖、侵袭、疾病进展和不良预后有关。在食管鳞癌患者，癌组织和癌旁组织中HDAC2呈现高表达。HDAC抑制剂TSA通过抑制HDAC2的表达，减少HDAC2诱导的MMP-2和MMP-9表达，达到抗肿瘤侵袭作用[26]。Zhang等[27]通过实时RT-PCR检测食管癌标本及癌旁组织发现HDACl高表达。利用质粒为基础的RNA干扰(RNAi)降低HDACl的表达，结果表明，通过抑制HDACl的表达可诱导食管癌细胞凋亡，并增强食管癌细胞的放射敏感性。Chen等[28]研究表明NAD(+)依赖的III型HDAC(SIRT1)与食管癌淋巴管浸润及预后相关。因此，HDACs可成为食管癌治疗的新靶点。

5 HDAC及其抑制剂的抗食管肿瘤细胞活性

5.1丙戊酸钠(valproicacid，VPA) VPA属于传统抗癫痫药物的一种，被归于短链脂肪酸(SCFA)的范畴内。其优势在于患者耐受性好且不会产生明显的副作用。研究显示，丙戊酸具有HDACi活性，能特异性的作用于HDACⅠ与HDACⅡ，具有明确的抗肿瘤作用[29]。目前关于丙戊酸应用食管癌的研究少见，仅2篇文献报道应用丙戊酸作为食管癌细胞放射增敏剂。丙戊酸可通过抑制非同源末端连接，延长放射诱导的食管癌DNA双链断裂；另外，丙戊酸可诱导组蛋白H3和组蛋白H4的乙酰化及诱导细胞凋亡，因此，丙戊酸可作为食管鳞癌放疗的增敏剂，提高放射疗效[30-31]。但丙戊酸对食管癌细胞的直接作用尚未见报道。

5.2曲古霉素A(trichostatinA，TSA) 曲古霉素A亦称曲古抑菌素A(TSA)的药用价值在近些年来被挖掘出来，被人们视作一类新型抗肿瘤药物。但是，受HDACi药物以及肿瘤特异性的影响，目前尚未完全阐明这种抑制剂的具体机制。已有研究结果显示，TSA能够对多种肿瘤细胞的增殖产生抑制作用，主要通过剂量依赖性以及时间依赖性方式来发挥作用[32]。EC9706 细胞会在施加以特定浓度 TSA的条件下发生凋亡现象，这一过程主要与TSA 作用EC9706 细胞引起 Bax、Bcl-2及caspase．8、caspase．9表达水平改变有关。Dong等[33]研究表明HDAC抑制剂曲古抑菌素A和丁酸钠可通过调节Bmi-1的表达，逆转食管鳞KYSE-150R细胞获得性放射抵抗。Ma等[34]研究表明HDAC抑制剂TSA通过抑制PI3K/Akt和ERK1/2通路激活，可抑制食管癌细胞生长。

5.3丁酸钠(sodiumbutyrate) 丁酸钠属于肠道黏膜营养剂的一种，其属于四碳脂肪酸盐。相关文献显示，丁酸钠能够对多种肿瘤细胞的增殖产生抑制作用，最典型的为结肠癌、肝癌、胃癌等，通过对肿瘤细胞分化以及基因表达等生理活动的影响，引发细胞凋亡现象。研究表明丁酸钠通过超乙酰化导致DNA和组蛋白分离，对NDRG1基因表达产生诱导作用并对食管癌EC9706细胞生长产生抑制作用[35]。在这一过程中，食管癌细胞分化会受到刺激而增强。因此，丁酸钠可作为食管癌的诱导分化剂。

6 展 望

通过本研究可知，国内外学者就组蛋白去乙酰化酶抑制剂在肿瘤治疗领域的作用进行了深入的探究。就现阶段而言，组蛋白去乙酰化酶抑制剂已经逐渐成为一种前景较好的新型抗肿瘤药物。组蛋白去乙酰化酶抑制剂在食管癌治疗领域的应用价值极高，其能够对食管癌细胞的生长产生抑制作用，增强食管癌细胞的放射敏感性并诱导其凋亡。不过，从客观上来讲，目前关于此课题的研究尚未成熟，如尚未探明组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导食管癌细胞停滞与凋亡的具体机制，尚未探索出对食管癌特别敏感的组蛋白去乙酰化酶抑制剂的合成筛选途径等。另外目前还并未针对组蛋白去乙酰化酶抑制剂单独使用以及与其他药物合并使用的问题进行临床实验对比。尽管已有研究仍然有诸多不成熟之处，但是从客观上来讲，随着此领域研究工作的不断深入，组蛋白去乙酰化酶抑制剂在食管癌临床治疗领域的价值必然会不断增强，食管癌患者的生存率也将大幅提升。