和胃反流康对胆汁反流性胃炎大鼠胃黏膜IKKβ表达的影响

李玉锋，谷文文，王垂杰

1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032

胆汁反流性胃炎(Bile Reflux Gastritis，BRG)是由于胃与十二指肠动力功能低下、幽门结构功能不全导致十二指肠内容物反流入胃，损伤胃黏膜，使胃黏膜发生充血、水肿、糜烂等病理改变[1]。现在西医对BRG的发病原因以及发病机制尚不明确[2]，治疗方案多采用质子泵抑制剂，促胃动力药以及黏膜保护剂。中医普遍认为BRG属于“胃脘痛”“吐酸”“嘈杂”范畴，和胃反流康为王垂杰教授通过多年临床经验总结的经方，临床上获得了患者的一致认可，该方剂主要功效为疏肝利胆，益气健脾，和胃降逆。本实验旨在通过检测和胃反流康对

BRG大鼠模型的治疗结果，探讨其对胃黏膜的修复作用机制，为以后临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物 和胃反流康药物组成：蒲公英20 g，柴胡、炒白术、香附各15 g，陈皮、白芍、半夏、枳壳、茯苓、甘草各10 g，黄连6 g。水煎为1.18 g/mL药液备用。裕尔(磷酸铝凝胶)，规格20 g/袋，华裕(无锡)制药有限公司生产，批准文号：国药准字：H19991100，使用前稀释为浓度0.54 g/mL水溶液。以上药物均购于辽宁中医药大学附属医院中药局。

1.2 实验动物 40只SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量(200±20)g，购于辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.3 主要试剂 牛黄胆酸钠、胰蛋白酶、卵磷脂(北京索莱宝科技有限公司)；兔单克隆抗体IKKβ(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.4 动物分组 将40只大鼠随机分为4组，每组10只。分别为空白组，模型组，磷酸铝凝胶组，和胃反流康组。

1.5 模型制备 反流液由牛黄胆酸钠2.5 g，胰酶1.5 g，卵磷脂0.25 g溶于100mL蒸馏水中制得，现配现用。从实验第1天开始，除空白组外，其余各组大鼠均按照1.5mL/100 g体质量比灌胃反流液以建立BRG大鼠模型，空白组大鼠灌胃等量蒸馏水，每天1次，共进行35天。

1.6 给药方法 磷酸铝凝胶组与和胃反流康组于造模第2周开始灌胃给药，每天于灌胃反流液6 h后按1mL/100g给药，1次。

1.7 取材及检测指标 末次给药结束后24 h禁食不禁水，行断颈处死，暴露腹部，迅速于无菌环境下取出胃部，沿胃大弯剪开，用生理盐水清洗胃内容物后剪取胃窦部组织。通过Western blot法测定胃黏膜上皮IKKβ 蛋白表达。RT-PCR法检测胃黏膜IKKβmRNA表达。

1.8 统计学方法 应用SPSS17.0软件，计量资料以(±s)表示，不满足正态性时选择秩和检验，满足正态性则组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齐者采用LSD检验，方差不齐者采用DunnettT3检验。结果以P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 空白组大鼠一般状态良好，毛发光泽，活动灵敏，进食正常，大便呈球状。模型组大鼠毛发枯黄杂乱，嗜卧懒动，进食量减少，大便稀溏，体质量减轻。和胃反流康组及磷酸铝凝胶组在治疗过程中，毛发渐渐恢复光泽，进食量和进水量逐渐增加，体质量均逐渐回升，但和胃反流康组大鼠效果较明显。

2.2 各组大鼠胃窦部胃黏膜组织IKKβ蛋白表达比较 见表1。与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织IKKβ蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，和胃反流康组、磷酸铝凝胶组大鼠胃黏膜组织IKKβ蛋白表达水平显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与磷酸铝凝胶组比较，和胃反流康组无明显差异(P＞0.05)。

2.3 各组大鼠胃窦部胃黏膜组织IKKβmRNA表达比较 见表2。与空白组比较，模型组大鼠IKKβmRNA表达升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，磷酸铝凝胶组及和胃反流康组大鼠IKKβmRNA表达均明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.01)。和胃反流康组与磷酸铝凝胶组胃黏膜IKKβ基因表达水平相比较，二者差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠胃窦部胃黏膜组织IKKβ蛋白表达比较(±s)

表1 各组大鼠胃窦部胃黏膜组织IKKβ蛋白表达比较(±s)

与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别空白组模型组磷酸铝凝胶组和胃反流康组n 10 10 10 10 IKKβ蛋白0.418±0.029 0.723± 0.108①0.568±0.050②0.393± 0.058②

表2 各组大鼠胃窦部胃黏膜组织IKKβmRNA表达比较(±s)

表2 各组大鼠胃窦部胃黏膜组织IKKβmRNA表达比较(±s)

与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01

组 别空白组模型组磷酸铝凝胶组和胃反流康组n 10 10 10 10 IKKβmRNA 1.000±0.000 3.755± 0.608①1.899± 0.265②1.336± 0.084②

3 讨论

BRG在中医范畴里归属于胃脘痛、嘈杂、泛酸。王耘[3]认为本病是肝胃郁热之邪灼伤胃络；《灵枢·四时气》论述：“邪在胆，逆在胃，胆液泄则口苦，胃气逆则呕苦”。《张氏医通》提出：“邪在胆经，木善上乘于胃，吐则逆而胆汁上溢，所以呕苦也。”由此可见，肝胆气机上逆，导致反流发生。

和胃反流康含有11味中草药，柴胡功效和解表里，疏肝理气，《本草纲目》中提到“柴胡宣畅气血引清气上行”，研究表明柴胡还具有缓解疼痛的作用[4]。香附理气止痛，有研究表明香附挥发油能够减轻小鼠胃内烧灼痛[5]，香附柴胡二者共为君药，相辅相成，共同缓解胃痛。香附还能够增强胃动力减少胆汁反流[6]；陈皮、枳壳二者来自同科不同种不同药用部位，为临床常用配伍，有理气调中的功效，《本草汇言》谓“陈皮可理气散寒，宽中行滞，健运脾胃，畅利脏腑，为脾胃之圣药。”《日华子本草》介绍枳壳“健脾开胃，调五脏，下气，止呕逆。”炒白术、茯苓益气健脾化湿，与柴胡为伍，具有抑木扶土之功效，与陈皮、枳壳共为臣药。黄连擅清中焦肝胆郁热，《本草纲目》“黄连去心火及中焦湿热”，蒲公英清热解毒，二者同为佐药。半夏和胃降逆，《本草求真》：“半夏辛温，能于脾中涤痰除垢，痰去而脾自健，故云能以健脾也。”白芍养血柔肝，缓急止痛，甘草调和诸药，诸药相伍，以达疏肝利胆，益气健脾，和胃降逆之功效。

IKK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，由Ramana KV等[7]从胞浆中提取的高分子量丝氨酸特异性蛋白激酶复合物。IKK复合物(亦名IκB激酶复合体)包括 IKKα、IKKβ和 IKKγ ，其中IKKα和IKKβ是催化亚基，IKKγ是调节亚基[8]。在静息状态下，IKK处于无活性状态。当细胞受到病原微生物、应激等刺激时，细胞内的一部分上游激酶活化，继而细胞内IKK磷酸化被激活。目前研究发现IκB蛋白家族主要包括7 个成员，在哺乳动物中起重要作用的为 IκBα ，IκBβ 和 IκBε[9]。IκBα是NF-κB活化过程中最强的负反馈因子[10]，NF-κB的活化发生和关闭都由IκBα保证，大部分的外界刺激因素都是通过IκBα的降解迅速而短暂地活化NF-κB。IκBα一旦缺失，则会显著推迟已活化的NF-κB信号通路的终止。但是，IκBβ和IκBε却能够缓冲系统活化的波动趋势，使NF-κB保持一个相对较长的响应时间[11]。在经典的NF-κB信号转导途径中，IKKα并不是必需的，而IKKβ的活化则起到了至关重要的作用[12]。IKKβ是促炎性细胞因子刺激诱导激活NF-κB的主要激酶[13]，IKKβ的缺失会严重影响NF-κB的活化。IKKβ 在NF-κB信号转导途径中发挥重要作用[14]。

钟国新等[15]曾通过穴位埋线对慢性萎缩性胃炎模型大鼠的治疗总结提出：在IKKβ/NF-κB通路中，IKKβ活化被抑制，则IκB降解也被抑制，这样能够有效减少NF-κB活化，从而减轻胃黏膜损伤。本实验中，BRG大鼠的胃黏膜组织IKKβ表达明显降低，可以合理推测和胃反流康可能通过下调IKKβ基因的表达，来抑制各种促炎因子基因的表达，以减轻各种炎性介质的产生，从而起到保护胃黏膜的作用。