真武汤及其拆方对肾小管上皮细胞氧化损伤的干预作用研究

孙静，危建安，余万霖，卢月，黄海定，韩凌

广东省中医院，广东 广州 510006

温阳利水名方真武汤已被证明对多种慢性肾脏疾病有效。本课题组前期研究表明，真武汤可明显增加阿霉素肾病模型大鼠24 h尿量，缓解低蛋白血症，使肾小球萎缩硬化及充血现象缓解，蛋白管型减少。用单侧输尿管梗阻(UUO)模型研究表明，真武汤可减少UUO大鼠的24 h尿量，降低血肌酐水平及尿素氮水平[1～3]。真武汤按照功能主治可以分为温阳功能与利水功能，并且每一部分都有相应组成的药物。但温阳功效与利水功效的相互关系如何，单独应用温阳药物，或者单独应用利水药物是否均具有治疗慢性肾脏病的作用，尚不得而知。本研究将真武汤按照其药物组成，拆方成温阳组(由附子、干姜组成)，以及利水组(由白术、茯苓、白芍组成)，分别制备真武汤组、温阳组、利水组含药血清，采用体外肾小管上皮细胞氧化损伤模型，研究真武汤，温阳组、利水组对肾小管上皮细胞氧化损伤的干预作用，为中医治则与治法的科学性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 人肾小管上皮细胞(以下简称HK-2细胞)购自中国典型培养物保藏中心。

1.2 实验药物及试剂 炮附子、茯苓、白术、芍药、生姜购自康美药业有限公司。1640培养基、胎牛血清(Gibco公司)。过氧化氢(H2O2)，MTT，SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa 公司)。Trizol(英津创津公司)。

1.3 实验设备 普通PCR仪9700、荧光定量PCR仪vii7(ABI公司)；高速冷冻离心机(BECKMAN公司，S-22R)；紫外可见分光光度计(岛津公司，UV2450)。

1.4 药物含药血清的制备 真武汤组方药由炮附子、茯苓、芍药、生姜各90 g、白术60 g，5剂药水煎剂浓缩至含生药量1.8 g/mL。温阳组方药由炮附子、生姜各90 g按3∶3比重水煎至含生药量0.75 g/mL。利水组方药茯苓、芍药各90 g、白术60 g，水煎至含生药量1.0 g/mL。实验动物：SPF级SD大鼠，体质量(250±25)g，购自广东省医学实验动物中心，许可证号为：SYXK(粤)2008-0094。大鼠分为正常组、真武汤组、温阳组、利水组，每组10只，按大鼠体质量，1mL/100 g剂量灌服给药。每天2次，连续给药6天，第6天早上空腹，给药1 h后用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，离心后吸出血清备用。

1.5 细胞培养 HK-2细胞用含10%胎牛血清的RPMI1 640培养基，于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，2～3天换液1次，细胞消化时采用0.25%含EDTA胰酶，传代比例为1∶ 4。

1.6 MTT法检测不同浓度H2O2对HK-2细胞增殖率的影响HK-2细胞以每孔103～104个细胞接种于2块96孔板中，每孔体积约200μL。种板24 h更换培养基。分别加入50、75、100、125μM的H2O2，分别孵育24h、48h，于培养结束前4h，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃继续孵育4 h。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入二甲基亚砜溶液，室温振荡10min，多功能酶联免疫分析仪于570 nm处检测OD值，观察细胞增殖情况。

1.7 各组含药血清对H2O2诱导HK-2细胞氧化损伤模型增殖率的影响 HK-2细胞以每孔103～104个细胞接种于96孔板中，每孔体积约200μL。种板24 h更换培养基，以75μm、100μm的H2O2刺激细胞，6%浓度的温阳利水组血清、温阳组血清、利水组血清以及正常组血清分别加入培养体系，共同孵育48 h。于培养结束前4 h，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃继续孵育4 h。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入二甲基亚砜溶液，室温振荡10min，多功能酶联免疫分析仪于570 nm处检测OD值，观察细胞增殖情况。

1.8 RT-PCR方法检测各药物组对HK-2细胞相关基因表达的影响

1.8.1 分组 HK-2细胞培养方法同前，将HK-2细胞种入6孔板中，培养24 h后，分为空白组、模型组、真武汤组、温阳组、利水组5组，空白组加入6%空白大鼠血清，模型组加入100μM的H2O2，真武汤组、温阳组、利水组分别加入含6%真武汤、温阳、利水组大鼠含药血清，同时加入100μM的H2O2。药物作用48 h后，各组细胞分别加入1mL Trizol，反复吹打混匀，收集至1.5mL离心管中，-80℃冰箱保存。

1.8.2 总RNA提取及cDNA合成 (1)总RNA提取：采用Trizol、氯仿提取法：在-80℃冰箱内取出用Trizol收集的细胞，解冻后加入200μL氯仿，振荡混匀，静置10min，置低温高速离心机13 000 r/min，4℃离心15min，吸出上清至一新的离心管中，重复上述步骤1次，吸出上清加入等体积异丙醇，轻轻混匀，13 000 r/min，4℃离心10 min，轻轻弃去上清，沉淀用75%乙醇洗2次，挥干，加入30μLRNAse-free H2O，收集RNA溶液。取10μL稀释至1mL，用A260/A280检测总RNA浓度和纯度。(2)cDNA合成：在冰浴条件下进行，总RNA取样1μL，PrimeScriptTMRTMaster Mix 4μL，补充水至20μL，轻柔混匀后进行反转录反应，反应温度37℃，15 min(反转录反应)，85℃ ，5 s(终止反应)。

1.8.3 引物设计 应用Invitrogen公司在线引物设计软件OligoPerfectTMDesigner设计，采用BLAST进行比对，由Invitrogen公司合成。合成 α-SMA、E-cadherin、生药囊(survivin)、TGF-β1、HO-1、HIF-1α等 6 对引物。

表1 引物信息表

1.9 统计学方法 数据采用graphpad prism 5软件进行统计。细胞增殖抑制率和mRNA表达结果组间比较采用t检验；P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度H2O2对HK-2细胞的损伤结果比较 见图1。与空白组比较，H2O2可造成HK-2细胞增殖受损，75μM～125μM的H2O2作用24 h，即可导致HK-2细胞增殖明显受损，增殖抑制率分别减少约25%、30%、40%，差异均有统计学意义(P＜0.05)，且呈一定剂量相关性。当H2O2作用时间延长至48 h时，对HK-2增殖的抑制作用更为明显，75μM～125μM的H2O2对HK-2细胞的抑制作用仍然存在，另外终浓度为50μM的H2O2作用48 h后，也表现出一定的抑制HK-2细胞增殖的作用，增殖抑制率约为85%，差异有统计学意义(P＜0.05)。因此将采用75μM以及100μM的H2O2作用48 h制备肾小管上皮细胞HK-2氧化损伤模型用于真武汤拆方的研究。2.2 各组含药血清对H2O2诱导HK-2细胞氧化损伤模型影响结果比较 见图2。与空白组比较，模型组细胞增殖受到明显抑制，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，真武汤组有明显的恢复受损细胞增殖的作用，差异均有统计学意义(P＜0.05)；但温阳组对受损的HK-2细胞增殖没有明显的恢复作用；利水组也可明显恢复受损HK-2细胞增殖的作用，差异均有统计学意义(P＜0.05)。100μM浓度的H2O2造模条件下，各含药血清组对受损细胞的恢复作用趋势与75μM的H2O2造模相类似。

图1 不同浓度H2O2对HK-2细胞氧化损伤的影响

图2 6%含药血清对不同浓度H2O2损伤的HK-2细胞生长的影响

2.3 各组含药血清对H2O2诱导HK-2细胞损伤模型缺氧基因表达的影响结果比较 见图3。与空白组比较，100μM的H2O2作用48 h造模，可明显使肾小管细胞HK-2缺氧相关基因HO-1基因表达下调、HIF-1α以及survivin基因表达上调，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，真武汤组、温阳组、利水组均可明显促进HO-1表达的恢复，进一步上调HIF-1α 表达，抑制survivin表达，差异均有统计学意义(P＜0.05)。同时真武汤组、温阳组、利水组之间，在对异常的缺氧相关基因表达的恢复方面未见明显差异。

2.4 各组含药血清对H2O2诱导HK-2细胞损伤模型纤维化相关基因表达的影响结果比较 见图4。与空白组比较，100 μM的H2O2作用48 h造模，可明显使肾小管细胞HK-2纤维化相关基因SMA、TGF-β1基因表达上调以及E-cadherin的基因表达下调，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，3个含药血清均可明显降低SMA的表达，上调E-cadlherin的表达，差异均有统计学意义(P＜0.05)，温阳组可下调TGF-β1基因表达，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

温阳利水名方真武汤源自张仲景《伤寒论》，主治脾肾阳虚、水湿内停。真武汤全方由5味药组成，方中附子回阳救逆，温肾助阳，为君药；茯苓健脾渗湿、甘淡利水，生姜宣肺温阳，散寒利水，两药共为臣药；白术补气健脾，燥湿利水，与芍药酸甘敛阴共为佐药[4]。

多项研究证明真武汤治疗慢性肾脏疾病有效。研究表明，真武汤低、高剂量组可明显降低UUO大鼠升高的尿KIM-1、E-clasterin、OPN含量，及UUO大鼠升高的外周血PAI-1、IL-6、MCP-1含量，提示真武汤可能是通过降低上述指标含量而达到缓解肾间质纤维化作用的[3，5]。

图3 6%含药血清对H2O2诱导HK-2细胞损伤模型缺氧基因表达的影响

“湿胜则阳微”是清代著名温热派医家叶天士所提出，明确指出湿邪阻滞阳气运化或阳气素虚，虚寒内滞，而出现湿胜阳微。这一论点对现代肾脏病的诊疗影响颇深。中医药在延缓慢性肾脏病的进展、改善患者症状方面积累了丰富的经验。尽管中医药在控制血压、血糖、贫血等方面处于劣势，但在减轻患者症状、改善营养状态、延缓进展、预防感染、提高患者生活质量等方面有独特的优势[6]。中晚期肾脏病患者常常出现顽固性水肿，并可有少尿、心悸、气急等凶险变证出现，温阳利水的方法在中晚期慢性肾脏病患者中应用甚广。但目前对这一治法治疗肾脏疾病的科学研究仍开展较少。鞠静等[7]等提出真武汤温阳机制包括兴奋下丘脑-垂体-肾上腺、下丘脑-垂体-甲状腺以温肾阳，降低一氧化氮及内皮素，抑制心肌细胞凋亡。温心阳，通过调节渗透压、调节水通道蛋白增加尿量以达到利水功效，但总体来说其作用机制仍未阐明。

真武汤中附子为君药，研究发现附子主要成分是乌头类生物碱、多糖、皂苷等，具有强心、保护心肌细胞、抗心律失常、抗炎镇痛、抗肿瘤等作用[8]。臣药茯苓的化学成分主要为多糖、三萜、脂肪酸、甾醇等，其中多糖类化合物和三萜类化合物是茯苓发挥药理作用的主要活性物质。茯苓多糖具有抗肿瘤、保肝、利尿、抗衰老、抗炎、降血脂、增强免疫等作用，茯苓三萜具有抗肿瘤、保肝、抗衰老、抗炎等作用[9]。臣药生姜的化学成分主要包括挥发油、姜辣素、二苯基庚烷、黄酮类等。其药理作用主要有促进消化功能、改善血液循环功能、止呕、抗炎抑菌、抗肿瘤及抗氧化等[10]。苍术酮是真武汤中佐药白术挥发油的主要活性成分，此外，多糖以及白术内酯等均是白术发挥药理作用的主要物质基础。白术的药理作用主要包括增强脾胃功能、调节胃肠运动、利尿、调节心血管系统、调节免疫系统以及神经系统、抗肿瘤、抗菌、抗炎等[11]。芍药的主要活性成分包括单萜及其苷类、三萜及甾体类、黄酮类、鞣质类等，其药理作用的研究主要集中在白芍总苷及酚类化合物上，具有抗炎、镇痛、保肝、抑制自身免疫反应的作用[12]。可以看出真武汤中具有利水以及治疗肾脏系统疾病的药物主要集中在茯苓与白术这两味药中，因此真武汤中通过茯苓与白术组成的“利水组”，配伍其他三味药组成的“温阳组”，实现可以治疗多种慢性肾脏疾病的作用。但对于“温阳”与“利水”的相互关系，单独应用“温阳”或“利水”是否对肾脏疾病也可以起到治疗作用，以及单用与合用的疗效对比等仍有待进一步研究。

图4 6%含药血清对H2O2诱导HK-2细胞损伤模型纤维化相关基因表达的影响

H2O2作用于肾小管上皮细胞诱导的氧化应激模型，会产生大量自由基，造成细胞氧化损伤，是目前常用的肾脏损伤的造模剂之一。本研究采用H2O2体外刺激肾小管上皮HK-2细胞制备氧化损伤模型，分别观察温阳组、利水组以及真武汤组含药血清的保护作用差异。结果显示对细胞损伤的修复以真武汤及利水组作用明显。

HO-1又称热休克蛋白，参与多种急性肾损伤[13～14]。低氧诱导因子HIF-1α的激活对组织适应缺血缺氧起关键作用。长时间缺氧的条件下对HIF-1α调节线粒体呼吸进行干预会导致活性氧簇(ROS)水平和细胞凋亡的增加，缺氧适应性的产生，能够使缺氧细胞增殖、血管生长、细胞能量代谢等顺利进行。因此HIF-1α 被认为具有细胞保护作用[15～16]。survivin能够调节细胞的有丝分裂，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡[17]。在乏氧或常氧条件下，HIF-1α 蛋白可通过结合survivin核心启动子片段中的潜在位点，上调survivin的表达[18]。本研究结果表明，真武汤及温阳、利水组有明显保护肾小管上皮细胞缺氧损伤的作用，三者差异不明显。

慢性缺氧会导致肾脏纤维化。肾小管上皮细胞间充质转分化(Epithelial tomesenchymal transition，EMT)是慢性肾脏病患者形成肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis，RIF)的主要病变途径。E-cadherin、SMA是代表EMT发生的标志物[19～21]，TGF-β1是目前公认的最主要致纤维化细胞因子，是诱导EMT过程的关键因素[22～23]。本研究结果表明，H2O2作用可使肾小管HK-2细胞间充质转分化明显增加，真武汤组、温阳组及利水组均表现出一定的抑制病理性纤维化基因表达上调的作用，但真武汤及温阳组效果略优。

总体而言，本研究结果证实真武汤具有明显的保护受损的肾小管上皮氧化损伤，抑制肾小管上皮转分化的作用。利水组对损伤模型的修复作用比较明显，温阳组抗肾纤维化及肾小管上皮转分化作用比较明显。本研究为中医治则治法的科学性提供了实验依据。