风湿性心脏病患者二尖瓣瓣膜组织中辅助性T细胞17和辅助性T细胞22的表达及临床意义

段长恩，秦卫玲，周朝元，韩培立，杨秀滨

(1.新乡医学院第一附属医院心血管外科，河南省神经修复重点实验室，河南 卫辉 453100；2.新乡医学院第三附属医院血液内科，河南 新乡 453003；3.中国医学科学院北京协和医学院阜外心血管病医院心血管外科，北京 100037)

伴发于A组乙型溶血性链球菌感染的自身免疫性反应是风湿性心脏病(rheumatic heart disease，RHD)发病的重要病因学基础，其病理表现以反复发作的心内膜炎和心脏瓣膜慢性纤维化及炎性细胞浸润为主[1]。该疾病若未得到及时有效的治疗，往往会诱发慢性心力衰竭，严重威胁患者的身体健康及生活质量。辅助性T细胞17(helper T 17，Th17)和辅助性T细胞22(helper T 22，Th22)是近年来新发现的2种不同于Th1和Th2细胞的CD4+效应T淋巴细胞，Th17细胞特异性地高表达白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)和白细胞介素-22(interleukin-22，IL-22)等因子，Th22细胞高表达细胞因子IL-22。研究证实，Th17和Th22细胞均具有独立的分化和发育机制，广泛参与炎症反应和创伤愈合过程，在调节自身免疫相关疾病的炎症应答中发挥着重要作用[2-3]。本研究通过对RHD患者病变的二尖瓣瓣膜组织中Th17和Th22细胞比例变化及相应细胞因子表达的研究，来探讨该疾病病变的分子学机制。

1 资料与方法

1.1一般资料选择新乡医学院第一附属医院心血管外科2016年5月至2017年5月确诊的40例RHD患者为观察组，术前均经二维超声心动图及彩色多普勒检查明确诊断，瓣膜病变均经术后病理学诊断证实。40例患者中男18例，女22例；年龄35～60岁，中位年龄43岁；单纯性二尖瓣病变21例，联合瓣膜病变19例。另选择同期30例非风湿性心脏瓣膜病变患者为对照组，其中男17例，女13例；年龄33～59岁，中位年龄44岁；单纯性二尖瓣膜脱垂20例，联合主动脉瓣膜病变(狭窄或二瓣畸形)10例。2组患者既往均无自身免疫性疾病和免疫抑制剂应用史，排除其他系统急慢性炎症。2组患者的年龄、性别分布差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有患者行体外循环下二尖瓣瓣膜置换术或主动脉瓣膜和二尖瓣瓣膜置换术。本研究经医院伦理学委员会批准通过，且患者签署知情同意书。

1.2主要试剂与仪器Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、胎牛血清及达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)均购于美国Invitrogen公司，人IL-17、IL-22酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒购于美国eBioscience公司，Trizol、实时荧光定量反转录聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，单克隆荧光鼠抗人异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)-IL-17、FITC-IL-22、FITC-γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、多甲藻黄素叶绿素蛋白标记的CD4抗体(peridinin chlorophyll protein,CD4-Percp-cy5.5)及相应的同型对照均购于美国Biolegend 公司；流式细胞仪购自美国BD公司，分光光度计购自上海达平仪器有限公司。

1.3瓣膜获取及细胞分离培养2组患者均在心脏瓣膜置换术中建立体外循环，在心脏停搏30 min内获取病变的二尖瓣瓣膜，无菌生理盐水反复冲洗瓣膜后剪切为2 cm×2 cm的组织块，按照文献[4]中的方法进行瓣膜组织细胞分离，分离后的细胞接种于6孔细胞培养板中，当细胞生长至80%～90%融合度时选取生长状态良好的细胞进行传代培养，每2～3 d更换培养液备用。

1.4流式细胞仪检测瓣膜组织中Th17细胞和Th22细胞的比例收集处于对数生长期的二尖瓣瓣膜细胞，应用DMEM培养液调整细胞浓度至1×109L-1并加入离子霉素(50 mg·L-1)及莫能霉素工作液(0.1 g·L-1)，混合均匀后接种于24孔细胞培养板内，每孔接种1 mL，于37 ℃、含体积分数5% CO2细胞培养箱中培养24 h。收集细胞于流式细胞仪工作管后分别加入细胞破膜液、FITC-IL-17、FITC-IL-22、FITC-IFN-γ及CD4-Percp-cy5抗体，室温避光孵育30 min，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2次后上机检测。对照管中加入相应的同型对照抗体，本研究中Th17细胞定义为CD4+IFN-γ-IL17+IL22-，Th22细胞定义为CD4+IFN-γ-IL17-IL22+。

1.5qRT-PCR法检测二尖瓣瓣膜组织中IL-17和IL-22mRNA表达将二尖瓣瓣膜组织置于液氮内充分研磨后采用Trizol法提取细胞总RNA，经紫外线分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测RNA合格后备用。按照qRT-PCR试剂盒操作说明分别检测IL-17及IL-22 mRNA表达。采用20 μL反应体系进行，扩增条件为：95 ℃预变性40 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。扩增结束后收集数据进行分析，采用2-△△Ct分析目的基因的相对表达量。目的基因及其内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物序列分别为：IL-17(326 bp)上游引物 为 5′-GGAAAGCTGGACCACCACA-3′，下游引物为5′-CACACCCACCAGCATCTTCTC-3′；IL-22(254 bp)上游引物为5′-TCTTGGTACAGGGAGGAGC-3′，下游引物为5′-CCTATCAGATTGAGGGAAC-3′；GAPDH(541 bp)上游引物为5′-AGCACCCCTGGCCAAGG-3′，下游引物为5′-CTTCTCCTTGGAGGCCATG-3′。

1.6细胞培养上清液中IL-17及IL-22水平检测将分离获得的二尖瓣瓣膜细胞分别培养至72 h，应用人IL-17及IL-22 ELISA检测试剂盒分别测定细胞培养上清液中IL-17和IL-22的水平，操作方法严格按照试剂盒说明书进行，酶标仪读取260 nm 波长处的光密度(optical density，OD)值，应用ELISA分析软件绘制标准曲线，并计算IL-17及IL-22水平。

2 结果

2.12组患者二尖瓣瓣膜组织中Th17和Th22细胞所占比例比较观察组患者二尖瓣瓣膜组织中Th17和Th22细胞占CD4+T细胞的比例分别为(3.95±0.81)%和(3.24±0.68)%，对照组患者二尖瓣瓣膜组织中Th17和Th22细胞占CD4+T细胞的比例分别为(1.34±0.25)%和(0.83±0.20)%；观察组患者二尖瓣瓣膜组织中Th17和Th22细胞占CD4+T细胞的比例显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；结果见图1。

A：CD4+-Percp-cy5.5细胞；B：对照组Th17细胞；C：对照组Th22细胞；D：观察组Th17细胞；E：观察组Th22细胞。

2.22组患者二尖瓣瓣膜组织中IL-17和IL-22mRNA相对表达量比较观察组患者二尖瓣瓣膜组织中IL-17及IL-22 mRNA的相对表达量分别为(5.03±1.43)和(4.67±1.12)，对照组患者瓣膜组织中IL-17及IL-22 mRNA的相对表达量分别为(2.38±1.03)和(1.98±1.34)；观察组患者二尖瓣瓣膜组织中IL-17、IL-22 mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.32组患者细胞培养上清液中IL-17和IL-22水平比较观察组患者细胞培养上清液中IL-17和IL-22水平分别为(25.39±3.86)、(20.10±4.15)g·L-1，对照组患者细胞培养上清液中IL-17和IL-22水平分别为(8.34±2.13)、(10.13±2.15)g·L-1；观察组患者细胞培养上清液中IL-17、IL-22水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

RHD是指急性风湿性心脏病后所遗留下来的以心脏瓣膜病变为主要临床表现的一类心脏疾病，是我国目前最常见的心脏瓣膜损伤因素之一。此类患者的心脏瓣膜组织发生增厚、纤维化及钙化，导致病变瓣膜瓣口面积狭窄和(或)关闭不全，随着病程的延长出现逐渐加重的心脏血流动力学紊乱及心肌损伤，并最终导致慢性心力衰竭[5-6]。迄今为止，RHD患者的早期预防及治疗仍缺乏行之有效的方法，晚期患者只能接受瓣膜置换手术，但由此产生的沉重经济负担及手术并发症如瓣周漏、血栓形成、抗凝过度及人工瓣膜炎等也是困扰临床专家的重要问题[7]。越来越多的研究证实，A组乙型溶血性链球菌感染诱发的自身免疫性损伤是该病的始动因素，尤其T淋巴细胞介导的细胞免疫在该病的发生、发展中起重要作用[8-9]。

Th17细胞是一类初始CD4+T细胞在不同细胞因子作用下分化而成的细胞亚群，以分泌大量的IL-17、IL-22、IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等功能性细胞因子为主要特征。Th22细胞是继Th17细胞亚群之后发现的又一类效应性T细胞亚群，因其高表达细胞因子IL-22的生物学特点成为免疫学家关注的热点。在IL-6和TNF-α作用下，CD4+T初始细胞可以向Th22细胞分化，同时A组β链球菌感染诱导的转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和IL-6有助于CD4+T细胞向Th17细胞系的发育[10]。Th17细胞及Th22细胞在炎症反应、自身免疫性疾病、肿瘤和移植排异等病理生理过程中发挥重要的调节作用，而炎症和自身免疫系统功能紊乱与心血管疾病密切相关[11]。文韵等[12]应用免疫组织化学法证实RHD患者瓣膜中Th17细胞及相关细胞因子的表达明显增高，Th17细胞的高表达可能是引起持续性瓣膜损害的一个潜在机制。BAS等[13]研究证实，RHD患者外周血Th17细胞的百分比以及血清中Th17/Treg细胞的比例明显升高，推测该细胞在瓣膜病变中可能起着重要的促进作用。GUILHERME等[14]研究发现，慢性RHD患者外周血T细胞中IL-17A存在过表达，还发现心脏瓣膜细胞中存在大量的IL-17和IL-23。杨新超等[15]研究发现，外周血Th22细胞及其细胞因子IL-22在冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生中起重要作用，可为早期诊断该病及评估冠状动脉病变程度提供临床依据。万军等[16]应用载脂蛋白E缺陷型小鼠复制动脉粥样硬化模型，流式细胞术检测Th22细胞在小鼠脾脏中比例变化及IL-22基因表达的变化，结果证实亢进的Th22型免疫反应具有促进动脉粥样硬化进程的作用。

本研究也发现，观察组患者的二尖瓣瓣膜组织中Th17及Th22细胞数量及对应基因的表达明显高于对照组，同时瓣膜细胞培养上清液中IL-17水平也明显升高，推测该2种细胞及其产生的主要细胞因子在瓣膜炎性及自身免疫性损伤中也起重要的促进作用，其能否成为该疾病临床治疗的一个潜在靶点，有待于进一步研究。