植物内重金属的赋存形态及分布特征分析方法研究进展

2018-09-04 02:07吴洁婷杨东广包红旭
中国环境监测 2018年4期
关键词:探针X射线重金属

吴洁婷,杨东广,王 立,包红旭,赵 磊,马 放

1.辽宁大学环境学院,辽宁 沈阳 110036 2.哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150090

近年来,经济的高速发展促使化石燃料大量使用,随着污水、污泥用于农用灌溉及汽车尾气排放污染加剧等现象的增多,环境中重金属含量逐年增高,生态环境(土壤、大气、水体等)的污染程度也日趋严重。重金属因其具有易于生物积累并可生物放大等特点,已成为环境污染修复一大难题[1],因此“十三五”以来,对环境中重金属污染进行分析监测,进而从源头预防污染发生并进行末端污染治理等研究工作均受到学者的广泛关注[2-3]。通过对植物中重金属的赋存形态及分布特征进行分析,进而对环境中大气、土壤的重金属污染来源、污染程度进行监测及解析,有助于对重金属污染起到生态预警的作用,同时也为构建合理的植物修复方案提供理论依据[4]。

目前通过指示植物(如苔藓、地衣)或者部分植物组织(如树叶、树皮等)监测环境的重金属污染状况,或对植物修复效果进行评价的研究较多[5-6]。选择合适的方法对植物体内金属的赋存形态、分布特征2方面进行解析,对于研究重金属的生物有效性及毒性作用、筛选出具有优良性状的植物品系、监测部分地区重金属污染状况、评价污染场地植物修复效果等具有重要意义。笔者对国内外有关植物中重金属赋存形态、分布特征的分析方法研究进展进行了概述,并比较了不同分析方法的优缺点,展望其未来发展趋势,以期为新分析方法的研究提供参考。

1 植物内重金属赋存形态分析方法

目前重金属的赋存形态分类较多,其中汤鸿霄[7]提出的“价态、化合态、结合态和结构态”理论认可度最高。根据不同的分类方法,其测定方法的选择也不尽相同,所以迄今为止并未有统一的标准,可根据实验条件、实验要求、重金属含量与形态、植物种类等因素进行选择。按照分析步骤可分为间接分析法和直接分析法:间接分析法是利用化学提取剂或者色谱仪等分离仪器基于不同重金属形态的物理化学性质的差异,将其进行提取或分离,再进行总量测定,从而得到各种形态的重金属含量;直接分析法是指利用光谱等技术对植物样品所含的重金属价态、元素构成、分子结构等采取分子或原子层面的检测方式,与间接分析法相比无需分离样品中重金属,能够准确分析重金属实际结构、形态。目前主要有X射线吸收精细结构谱(XAFS)、X射线光电子能谱(XPS)、傅立叶变换红外光谱(FTIR)等。表1对比介绍了常用的植物内重金属赋存形态分析方法。

表1 植物内重金属赋存形态分析方法Table 1 Analysis methods for heavy metal speciation in plants

1.1 间接分析法

1.1.1 化学提取

化学提取法按照提取次数可分为单级提取法和多级提取法。由于植物中重金属的化学形态较为复杂,所以目前多级提取法在重金属赋存形态上的使用更多[13]。多级提取法是利用选择性依次增强的提取剂对颗粒样品中不同理化性质的重金属元素进行分级提取的方法[14]。目前常用的化学提取法为Tessier法[15]及欧洲共同体参考物机构(BCR)的规定方法[16],其他方法大多是在它们的基础上进行优化,表2简要介绍了Tessier和BCR 2种方法所用的化学态、提取剂及提取条件。

表2 植物内重金属化学提取法Table 2 Chemical extraction methods of heavy metals in plants

马荣辉等[17]进行黑土-水稻系统中铜形态研究时发现,土壤中Cu形态与植物内Cu形态有显著的相关性,通过施加猪粪能降低土壤中活性态Cu含量,使其由非结合态向结合态转化,相应地植物内水溶态、碳酸盐提取态等植物可利用的Cu形态比例下降,其与土壤Cu变化呈现正相关。这说明植物内重金属形态与土壤重金属具有相关性,可通过植物间接分析土壤重金属污染种类及程度。传统Tessier法存在提取剂缺乏选择性、提取过程中有重吸附和再分配现象、缺乏统一标准分析方法、分析结果的可比性差等问题,导致实验结果误差大。针对上述问题,研究者从改良提取剂,采用准确度更高、更灵敏的检测方法,对已有的几种金属形态进行进一步划分等方面对其进行了改进。吴慧梅等[18]对茶叶中的6种金属元素进行BCR三步简化分析,将重金属依次分为乙醇提取态、盐酸提取态和残渣态,实验结果表明,3种形态的金属含量之和占各元素总量的80%以上,回收率与标准偏差满足形态分析的要求。但该方法也存在对金属形态分类较为简单、无法获取更多的金属形态信息、与其他方法所得结果难以进行比较等缺点。目前,对于化学提取法的研究主要集中于特异性提取剂的选择、新分类方法的建立等方面。

1.1.2 色谱分离

为了更好更快地对植物中的金属进行分类提取,有研究者借助分离器(如高效液相色谱、气相色谱等),利用不同形态金属在色谱柱内迁移能力的差异,实现金属种类、形态的高效分离,然后采用原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱(AFS)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等检测仪,对分离后的金属含量进行检测。

色谱分离器-检测器联用技术较为灵活,可选择的方式较多,目前没有统一的联用形式,但是高效液相色谱(HPLC)因其较强的分离能力常被用于分离装置,而电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)因其较高的灵敏度与准确度、较低的检出限等优点常被用于检测装置。TIE[19]利用基于高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术(HPLC-ICP-MS)对金针菇中的Se进行分析,对水溶性蛋白经过提纯后,结果表明存在至少6种含Se蛋白质,占可溶Se总量的约7.0%。SANG等[20]利用HPLC-ICP-MS对水稻中的As进行检测,结果表明主要含As(Ⅲ),其次为As(Ⅴ),含量最低的为有机As。除了高效液相色谱以外,还有人采用其他的分离方式,如SANTHA等[21]利用离子交换色谱作为分离装置,采用ICP-MS作为检测装置对芸薹叶中Se复合物形态进行研究,发现其主要以蛋氨酸-甲基硒和半胱氨酸-甲基硒形态存在,且后者含量较高。但是联用技术方法本身也有局限性,它能对不同形态的重金属进行分离,但不能给出重金属化合物的结构信息,因此需与其他分析方法联用(如电喷雾质谱等)。

1.2 直接分析法

1.2.1 XAFS

XAFS通过对样品的入射X射线吸收曲线上下波动产生的精细结构进行测定及计算,对原子的排列情况及周围原子配位状况等进行分析,从而分析其结构特征[22]。XAFS按能量范围可分为扩展X射线吸收精细结构(EXAFS)和X射线吸收近边结构(XANES)2个部分。EXAFS能反映吸收X射线原子的邻近原子间距、种类和配位数等信息;而XANES能反映原子的化学价态和配位状态[23]。

不同的元素有不同的吸收边能量,且元素间干扰较小。因此,XAFS在土壤、植物等环境样品的研究中显示出独特的优势,已被开始用于分析其重金属分子形态。BLUEMLEIN等[24]对藤本植物根部As形态进行检测,测得大部分As是As(III),并与肽S(53%)结合形成As(III)-PC复合物。同时EXAFS数据也证实了As—S和As—O键的存在,推测这2种键是在植物中形成的,可能为植物缓解As毒性的机制之一。JIN等[25]对用As(Ⅴ)处理过的拟南芥进行检测,测得拟南芥中出现As(Ⅲ),并且与O、S配位,推测拟南芥可能在体内将高毒性As(Ⅴ)转化为毒性较低的As(Ⅲ),并通过形成络合物,缓解重金属的毒性。XAFS因其具有灵敏性强、在不破坏样品的情况下可进行原位测定、能准确分析金属形态和结构等优点,在植物中重金属形态分析上具有独特的优越性。但是该法设备投资以及维护成本较高、操作较为复杂、需要利用已知结构的标准物质确定化学键的结合形式或利用现有的同步辐射图谱及数据库资料进行分析,增加了未知样品当中物质形态监测的难度。

1.2.2 XPS

XPS是根据光电效应对电子能量进行检测的谱学技术。利用X射线轰击样品原子的内层电子,使其处于激发态。当激发态电子能量高于真空能级就会逸出原子外,通过对光电子能量进行分析可以测出元素种类及其所处的化学环境,进而推测出该元素的化学结合状态和价态[26]。

XPS可对元素化学态进行分析,从而分析出化合物组成,而且有检测速度快、应用范围广、无需前处理等优点。在植物生理学、分子生物学等方面均有良好应用。TAN等[27]对小麦茎内铅的化学形态进行分析,发现在小麦茎基部Pb2+主要与—COOH及—OH结合形成配位体,从而有较好的吸收性。斯冬芳[28]对三角褐指藻中Cd的络合作用进行研究,发现细胞壁上—COOH、—OH和—NH2与Cd形成络合物较多,从而减少细胞质内游离Cd的含量,推测这种细胞壁基团络合作用与重金属解毒机制有关。尽管XPS在植物样品检测上应用较多,但仅限于样品表面10 nm范围内的元素,除此之外,样品深层元素无法测出,高真空条件较难维持,灵敏度、精密度与空间分辨率较低,仪器成本昂贵等不足均使其应用受到一定限制。

1.2.3 FTIR

2 植物内重金属分布特征分析方法

重金属在植物内的分布,实质上是指植物内重金属在不同部位的含量,其结果对于分析土壤或大气环境重金属污染的指示作用、揭示植物对重金属胁迫的抗逆性信号机理、预测重金属污染发展趋势、研究植物耐受机制等方面提供数据基础。表3对植物内重金属分布特征常用的分析方法(差速离心法、电镜显微技术、荧光探针)进行了简要说明及比较[32-33]。

表3 植物内重金属分布特征分析方法Table 3 Analysis methods for heavy metal distribution characteristics in plants

2.1 差速离心法

差速离心法是对植物中重金属在亚细胞水平上的分布特征进行分析的常用方法。其基本原理是先将含有提取缓冲液的样本细胞打碎,根据不同细胞器的质量差异,通过差速离心机分离亚细胞组分,将细胞分为细胞壁及残渣、细胞核、线粒体及叶绿体等细胞器、可溶部分等组分,再分别对各组分进行检测。MING[38]对芸苔和小白菜钒的组织积累和亚细胞分布特征进行分析,结果显示钒在细胞壁中含量最高,其次是可溶性部分,两者之和占总量的90%以上。极端情况下,钒亚细胞分布在细胞核、线粒体和叶绿体(仅占总钒的6.8%),表明细胞壁和可溶性部分是主要的钒累积位点。XIN等[39]对2个萝卜品种中Cd的亚细胞分布进行了比较,发现Cd敏感基因型H 4中所有亚细胞组分的Cd浓度都高于Cd耐性基因型L 19,同时,大部分Cd分布于H 4根系细胞壁,而L 19根系Cd的2个品种的叶片中Cd主要贮藏在可溶性部分,推测这可能涉及耐Cd毒性机制。由于该方法具有仪器要求低、操作简单、设备投入少、简便快捷等优点,当实验室不具备扫描电镜等显微成像仪器时,为了分析植物对重金属的解毒原理,可采用此法对重金属亚细胞分布(细胞器水平)进行分析。但是由于该法对操作精确度要求较高、样品处理效果直接影响实验结果、不能以成像方式直观观察重金属亚细胞分布特征、会对样品细胞造成破坏等,限制了其在活细胞原位检测的使用。

2.2 电镜显微技术

电子显微镜是利用电子源发出的电子轰击样品,电子与物质发生作用从而发生二次电子、透射电子、俄歇电子、X射线等信号,然后对这些信号及逆行分析,从而观察样品区域结构、物质组分、电子分布等情况的电子光学装置[40]。按结构和用途可分为透射式电子显微镜(TEM)、扫描式电子显微镜(SEM)、反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等。电镜只能将样品进行显微成像,还需借助光谱技术将样品组分中重金属含量测定出来,两者结合就能将样品中重金属在不同位置的含量显示出来,即观察重金属的分布特征,而X射线能量色散光谱仪(EDX)是其中最常用的光谱技术。

在对植物中重金属进行细胞层面的分布特征分析时,为了直观地观察到重金属的分布情况,电镜通常与EDX联用。EDX本质上也是借助测定样品受X射线激发时所发出的特征X射线波长和强度,对元素进行定性、定量测定。LU等[41]利用SEM-EDX测定红树中Cu、Zn、Pb和Cd的细胞分布和化学形态,结果表明,Cd主要分布在表皮、皮层、内皮层和一些木质部薄壁的壁上,其他金属也呈现类似的分布趋势,且Cd浓度在表皮细胞最高,细胞壁浓度大于细胞间隙浓度。推测根表皮是金属运输的主要障碍,与红树植物的耐受机制有关。但是该法也有不足之处,例如普通电镜只能提供瞬时的二维图像,难以观察样品三维立体结构,样品操作条件需保持真空等问题。因此学者在普通扫描电镜的基础上开发了扫描探针显微镜(SPM)、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)等技术。这些技术以激光为光源,将扫描电镜与荧光技术相结合,对样品扫描的分辨率、灵敏度等提供更好的成像条件,同时也可以对样品的三维结构进行实时检测。张卫娜等[42]采用LSCM对受Cd胁迫的拟南芥根细胞进行观察,对于Cd在根中亚细胞分布的观察取得了良好的实验效果。但由于此技术发展较晚、设备成本较高、操作较为复杂,需使用具有一定质量要求的荧光探针进行标记再扫描成像,所以扫描速度受到限制,检测效率较其他显微技术略低,但随着激光光源、检测器等方面的研究,该项技术的应用前景仍十分广阔。

2.3 荧光探针标记

荧光探针标记是指利用强荧光的标记试剂对待测物进行标记,生成具有高荧光强度的结合物,根据探针种类、荧光强度对待测物质进行定性定量分析[43]。荧光探针分子通常由识别基团、荧光基团、连接体部分3个部分组成[44]。按荧光探针物质本身的性质将其分为有机物探针、纳米材料探针、蛋白探针等。对重金属的检测主要采用荧光素类、罗丹明类、香豆素类等化合物。

荧光探针灵敏性高、无需预处理即可对活细胞进行原位检测、选择性好(荧光探针可设计性强,根据被测物的种类和结构,能对探针形态及结构进行设计),现在植物活细胞中重金属分布检测的应用越来越多。姚宏伟等[45]采用Zn特异性探针HL 1对拟南芥和谷子中的Zn进行检测时,发现在拟南芥中Zn2+主要分布于细胞间隙以及叶表皮毛的外周和表层;而谷子叶片中的Zn2+分布在细胞间隙以及维管组织中较多,且荧光强度与浓度表现出正相关。JI等[46]采用一种高选择性的“开启”荧光探针在其他金属离子的干扰下测定拟南芥中Zn2+,结果显示此探针灵敏度达到3.2×10-12,且Zn2+主要被隔离在拟南芥的液泡中,荧光强度表现强烈。尽管荧光探针在活细胞金属分布检测上具有明显的优势,但该法尚有不足,比如探针分子在活细胞中的均匀分布是最大难点之一,而且当细胞中含有色素时会对荧光产生干扰,需要提前对样品进行脱色处理,这些缺点限制了其应用。

2.4 X射线荧光(XRF)

XRF分析是指利用激发光源发出的初级X射线轰击被测样品中基态原子,当被X射线激发时,基态原子的内层电子会向外层跃迁从而挣脱原子核的束缚,而电子跃迁产生的空位将由外层电子填补,电子从高能态跃迁到低能态会损失能量,从而使原子在特定的能量下发出荧光[47]。XRF分析在环境样品的检测方面已趋于成熟,另外因其检出限低、灵敏度高、可对样品进行原位检测、无需前处理且可同时对多元素进行分析等特点,目前在植物样品重金属分布检测上应用较多。王君玲等[48]利用微束X光对大米中的P、Cl、K、Ca、Fe、Cu、Zn元素进行扫描时发现前4种元素主要集中在大米的胚芽处,而后3种元素分布较为均匀,其含量自胚芽至整个胚乳呈递减趋势。可见XRF分析在植物样品重金属微区分布检测上有着良好应用。但由于普通XRF分析自身具有局限性(如常规射线源强度不够造成检出限较低、光线空间分布不均匀使得空间分辨率较低等问题),限制了它对痕量重金属微区分布的检测。

为了提高检出限以及空间分辨率,有人采用同步辐射装置作为激发光源,利用带电粒子在同步加速器中做变速运动时产生的电磁辐射作为激发光源对样品进行分析。THOMAS等[49]采用同步辐射光源激发豇豆幼苗根部的As,发现As在根尖的分生组织含量最高,其次是根的边缘细胞及内皮层,推测As的积累导致分生组织的永久性损伤,并通过边框细胞积累高浓度的As限制其运动,从而使豇豆对As具有一定的耐受性。陈璐等[50]利用SR-XRF对植物三七根部As进行细胞层面分布特征的检测,实验发现三七根部中的As主要分布于表皮细胞,并且有向维管组织运输的趋势。当浓度大于40 mg/L时,会使根部腐烂从而造成植物死亡。实验结果表明SR-XRF在细胞层面上对植物中重金属分布特征进行检测取得了良好的实验结果。与其他XRF分析相比其区别在于,SR-XRF是采用电磁辐射作为激发光源而非同位素放射源。因此同步辐射具有光通量大、频谱宽、分析速度快、偏振性好等优点。但是该装置具有价格昂贵、操作复杂、光源容易受环境条件影响等缺点。

3 展望

植物能够直观反映受损生态系统对环境胁迫因子的综合响应,对于研究重金属污染的迁移转化规律及其对生态系统的长期影响具有特殊优势。植物监测在现代环境污染预警与治理等方面的作用已引起广泛关注。随着现代分析仪器的发展,仪器对植物中重金属的赋存形态及分布特征分析方法的灵敏度及准确度也不断提高,针对现有植物样品重金属信息分析方法的特点,未来发展方向包括以下3个方面:

1)目前对于植物内重金属的检测尚未建立国家标准,这在很大程度上影响了实验数据的准确性及可比性,因此建立以兼顾统一性及可靠性分析检测方法为主体的强制性标准和推荐性标准,提高分析设备的自动化程度,实现样品的快速、批量测定,降低测定成本,开发更加完善、简便的新分析方法十分必要。

2)由于植物往往表现出对区域内所有污染物的综合响应,因此,如何从植株个体、器官、组织、细胞及细胞器水平加深植物与重金属在环境中迁移转化规律的相关性及互作机制的研究,对于促进植物监测技术的成熟具有重要意义。

3)对不同地区植物内重金属形态、分布特征进行调查,通过互联网建立数据共享平台,解析当地重金属污染程度、种类及来源,有助于及时丰富重金属污染指示植物及修复植物的种类库,构建合理的污染预防及修复方案。

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