肉桂酸苄酯分子印迹膜电化学传感器的制备

徐 慧， 张银志， 孙秀兰， 张入元

(1.宁波方太厨具有限公司，浙江宁波 315336；2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122；3.江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

肉桂酸苄酯(Benzyl cinnamate，3-Phenyl-2-propenoic acid phenylmethyl ester)是一种酯类合成香料，主要采用酯化法和缩合法进行合成，大多存在苏合香脂、妥卢香脂和秘鲁香脂等[1]，具有苏合香膏香香气[2]，主要用作东方型香精及人造古龙涎香的定香剂，也可用作香皂香料[3 - 4]。但是肉桂酸苄酯是一种香味过敏原[5]，能引起易过敏人群的化妆品皮肤病[6]，所以开发针对化妆品中痕量肉桂酸苄酯的分析检测方法具有非常重要的现实意义。

目前对于化妆品中过敏原的检测方法主要有斑贴试验[7]、气相色谱法[8]、气相色谱-质谱法[9]、高效液相色谱法[10]等。斑贴试验是诊断化妆品过敏的重要手段。靳云霞通过斑贴试验研究360例皮肤过敏患者皮炎和湿疹的过敏原因，结果显示硫酸镍、芳香物质、松香以及对苯二胺等致敏性较高即抗原阳性率较高[11]。香精香料等芳香物质过敏原主要是通过高效液相色谱法和气-质联用技术进行检测。王超等[12]通过毛细管气相色谱-质谱法测定了化妆品中16种香精香料，该方法样品用量少，灵敏度和准确度高，前处理简单，可同时测定化妆品中16种香精香料。

但是我国的化妆品质量检测手段和安全性评价体系依然不够完善[13]，检测水平落后，化妆品质量安全保障相关技术能力有待提高。分子印迹电化学传感器具备高灵敏度和高选择性的优点，便于自动化和现场检测使用，检测成本低，已成为研究热点[14 - 15]。本研究以对巯基苯胺为单体，肉桂酸苄酯为模板分子，采用电聚合法制备分子印迹聚合物膜，构建了基于对巯基苯胺-金纳米粒子的肉桂酸苄酯分子印迹膜电化学传感器检测方法，实现了对化妆品样品中痕量肉桂酸苄酯的定量检测。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

CH1760电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；PB400-4型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；KQ-100E超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；s-4800扫描电子显微镜(日本，日立公司)。

肉桂酸苄酯(Benzyl Cinnamate)、苯甲酸苄酯(Benzyl Benzoate)、水杨酸苄酯(Benzyl Salicylate)，购于百灵威科技有限公司；对巯基苯胺(p-ATP)、四丁基高氯酸铵(TBAP)，购于Sigma公司；HAuCl4、K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]、KCl，购于国药集团；其他试剂均为分析纯。实验用水为自制超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1肉桂酸苄酯分子印迹电极的制备电极预处理：将Au电极(Φ=2 mm)置于新鲜配制的10 mL Prianha 溶液中浸泡15 min，超纯水清洗，之后分别用0.3、0.05 μm Al2O3进行抛光处理，接着依次在无水乙醇和超纯水中超声清洗，氮气吹干后，在2.5 mmol/L K3[Fe(CN)6]电解液中，于-0.2～0.6 V电位范围内，以100 mV/s的速率进行循环伏安法扫描，最后在0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)中，以100 mV/s的速率在-0.2～0.6 V电位范围内进行循环伏安法扫描对电极进行活化，以得到稳定的电流响应。肉桂酸苄酯分子印迹膜制备过程：Au电极表面制备肉桂酸苄酯分子印迹聚合膜过程如图1所示，分为以下几步：(1)对巯基苯胺自组装：将Au电极置于20 mmol/Lp-ATP乙醇溶液中，室温浸泡24 h，之后用无水乙醇和超纯水彻底清洗以去除未吸附的对巯基苯胺，氮气吹干，备用。(2)肉桂酸苄酯的氢键吸附：将p-ATP自组装后的Au电极浸入含有10 mmol/L肉桂酸苄酯的无水乙醇溶液中氢键吸附4 h，用无水乙醇和超纯水清洗后，氮气吹干，备用。(3)电化学聚合：将p-ATP和肉桂酸苄酯组装后的电极浸入10 mL含2 mmol/L肉桂酸苄酯，5 mmol/L 对p-ATP，0.2 g/L HAuCl4，50 mmol/L TBAP的无水乙醇溶液中,采用循环伏安法扫描，扫描电位范围为-0.3～1.0 V，扫描速度为50 mV/s，扫描次数为12次。(4)模板分子的去除：将电聚合后的电极用无水乙醇和超纯水清洗后，浸入含0.2 mol/L HCl的乙醇-水(9∶1,V/V)的溶液中25 min以除去肉桂酸苄酯膜板分子，之后依次用无水乙醇和超纯水进行清洗，氮气吹干，备用。

图1 Au电极表面肉桂酸苄酯分子印迹聚合膜的制备过程Fig.1 Preparation procedure for the benzyl cinamate-imprinted polymer film on a Au electrode

非分子印迹聚合物膜的制备过程除不加模板分子肉桂酸苄酯外，其他均与印迹聚合物膜的制备过程相同。

1.2.2电化学测定电化学工作站采用三电极工作体系，工作电极为自制的分子印迹膜电极，参比电极为甘汞电极，对电极为铂丝电极，电解质溶液为含0.1 mmol/L KCl 的2.5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液。循环伏安(CV)测定条件：电位范围为-0.2～0.6 V，扫描速度为100 mV/s，差分脉冲伏安(DPV)测定条件：初始电位0.6 V，终止电位-0.2 V，电位增量0.004 V，振幅0.05 V，脉冲宽度0.05 s，采样宽度0.0167 s，脉冲周期0.2 s。交流阻抗(EIS)测定条件：初始电位0.2 V，高频100 000 Hz，低频1 Hz，振幅0.005 V，静止时间2 s。

1.2.3分子印迹膜传感器用于样品测定以从无锡欧尚超市购买的多芬洗发水为样品(液相色谱分析未检出肉桂酸苄酯)，进行基质添加回收率试验。准确称取1.0 g样品，添加浓度为10、100、1 000 pmol/L的肉桂酸苄酯，加入6 mL乙腈超声提取15 min，5 000 r/min离心10 min，取上清过0.2 μm微孔薄膜过滤，滤液用氮气吹干并用无水乙醇复溶，采用分子印迹膜传感器进行电化学分析。

2 结果与讨论

2.1 肉桂酸苄酯分子印迹膜传感器制备方法及机理

本实验采用自组装和电聚合方法制备分子印迹聚合物膜，以含有-SH和-NH2的p-ATP为功能单体，p-ATP的-SH与Au电极表面通过Au-S键结合，从而形成一层稳定的自组装单体膜。肉桂酸苄酯模板分子中的-OH与p-ATP的-NH2通过氢键作用力相结合，模板分子的氢键吸附增加了有效结合位点的数量，提高了分子印迹传感器的灵敏度。在电聚合的过程中，HAuCl4被还原成Au纳米粒子，作为交联剂与被氧化的p-ATP聚合，形成聚巯基苯胺-Au纳米粒子复合导电膜。在肉桂酸苄酯模板分子的存在下，可以将模板分子固定在分子印迹膜中。通过物理或化学方法将被固定的模板分子除去，从而在聚合物中形成了与模板分子在空间和结合位点上相匹配的具有多重作用位点的空穴，这样的空穴对模板分子具有特异性的选择性。本研究利用乙醇和HCl去除固定的肉桂酸苄酯模板分子。

2.2 分子印迹膜的电聚合

肉桂酸苄酯分子印迹膜电聚合液由含有2 mmol/L的肉桂酸苄酯，5 mmol/Lp-ATP，0.2 g/L HAuCl4，50 mmol/L TBAP的无水乙醇溶液组成。分子印迹膜的电化学循环伏安聚合图如图2A所示。在第一圈循环伏安扫描过程中，在0.917 V电位处出现了一个氧化峰，并随着扫描次数的增加逐渐减小并趋于稳定。这说明p-ATP聚合物膜沉积在了电极表面，电子传输能力减弱，电流下降。图3是分子印迹聚合物膜的扫描电镜图，电极表面上不规则的颗粒也从侧面说明聚合物膜成功的沉积在了电极表面。

作为对照，在非分子印迹膜的电聚合过程中，其循环伏安扫描图(图2B)与印迹膜电聚合扫描图几乎相同，说明在选定的电聚合电势范围内，肉桂酸苄酯不存在电化学活性，不会影响其化学稳定性，因而可以在电聚合过程中完整的固定于分子印迹膜中。

图2 印迹膜(A)和非印迹膜(B)的电聚合循环伏安扫描图Fig.2 Cyclic voltammograms of imprinted film (A) and non-imprinted film (B) obtained during electro-polymerizationpotential range:-0.3 - 1.0 V;scan rate:50 mV/s;scan cycles:12.

2.3 分子印迹膜电极的电化学表征

图3 分子印迹聚合物的扫描电镜(SEM)图Fig.3 SEM image of molecular imprinted polymer

为了研究Au电极在修饰前后的变化，采用循环伏安法、差分脉冲伏安法、交流阻抗法，以[Fe(CN)6]3-/4-为探针进行电化学表征。实验结果如图4所示。裸Au电极(图4A曲线a)与表面电化学沉积肉桂酸苄酯分子印迹聚合物膜Au电极(图4A曲线c)的循环伏安曲线相比，在聚合后的电极上，观察不到[Fe(CN)6]3-/4-的氧化还原峰。这说明聚合物膜沉积在了电极表面，使[Fe(CN)6]3-/4-无法扩散到Au电极表面。当洗脱去除肉桂酸苄酯模板分子后，出现了[Fe(CN)6]3-/4-的氧化还原峰(图4A曲线b)。但是和裸电极相比，在洗脱后的电极上的氧化还原电位差增大并且峰电流减小。

在差分脉冲伏安图(图4B)中，[Fe(CN)6]3-/4-在裸Au电极上的氧化峰电流为64.8 μA。在修饰后的电极上，氧化峰电流几乎为零。而当模板去除后，[Fe(CN)6]3-/4-的氧化峰电流增大到40.08 μA。这也说明电极表面沉积上分子印迹聚合物膜并且成功洗脱掉了模板分子。图4C为裸电极以及印迹膜电极在洗脱前后的交流阻抗图。在电极表面沉积上印记膜之后，阻抗值急剧增大(图4C曲线c)。洗脱掉模板分子后，阻抗值明显降低(图4C曲线c)，但比裸电极(图4C曲线a)的阻抗值大。这与图4A和图4B中峰电流值的变化相一致。

图4 裸Au电极(a)、去除模板后(b)和去除模板前(c)的电极在[Fe(CN)6]3-/4-中的循环伏安(CV)图(A)、差分脉冲伏安(DPV)图(B)和交流阻抗(EIS)图(C)Fig.4 (A) CVs,(B) DPVs and(C) EIS of [Fe(CN)6]3-/4- at(a) bare Au electrode,MIP sensor after(b) and before(c) template removal

作为对照，对于非印迹膜修饰电极，在相同条件下对其在[Fe(CN)6]3-/4-中的循环伏安、差分脉冲伏安、交流阻抗行为进行了电化学表征，如图5所示。在裸Au电极图(5A曲线a)上，[Fe(CN)6]3-/4-呈现出一对明显的准可逆氧化还原峰。但是在非印迹膜沉积在电极图(5A曲线c)表面后，氧化还原峰消失并且洗脱后的电极(5A曲线b)的循环伏安图几乎没有变化。这是因为在肉桂酸苄酯不存在的条件下，在电极表面形成的非印迹膜没有可以结合的位点，在洗脱过程中去除的没有发生聚合反应的对p-ATP导致了可以忽略的峰电流的微小变化。这表明非印迹膜电极对肉桂酸苄酯没有选择识别性能力。

非印迹膜电极在洗脱前后的电流值(图5B)和阻抗值(图5C)几乎没有变化，这也证明了在印记膜的沉积过程中，模板分子被有效的固定于印迹膜中，并在洗脱后，形成了[Fe(CN)6]3-/4-电化学探针可以通过的通道。

图5 裸Au电极(a)、去除模板后(b)和去除模板前(c)的非印迹膜电极在[Fe(CN)6]3-/4-中的循环伏安(CV)图(A)、差分脉冲伏安(DPV)图(B)和交流阻抗(EIS)图(C)Fig.5 (A) CVs,(B) DPVs and(C) EIS of [Fe(CN)6]3-/4- at(a) bare Au electrode,NIP sensor after(b) and before(c) template removal

2.4 印迹膜电极对肉桂酸苄酯的响应能力

沉积在Au电极表面的肉桂酸苄酯分子印迹膜去除模板分子后，在表面或内部形成了可以与模板分子特异性结合的空穴。而电化学探针[Fe(CN)6]3-/4-可以通过这些空穴到达Au电极表面，发生氧化还原反应。当含有肉桂酸苄酯的溶液滴加到电极表面时，便会与这些空穴结合，阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-探针在底液和电极表面间的氧化还原反应，致使电极电流发生变化。根据分析物浓度和电流变化的关系，可以实现肉桂酸苄酯的定量分析检测。

图6 印迹膜电极在不同浓度的肉桂酸苄酯中孵育6 min后的差分脉冲伏安(DPV)响应Fig.6 DPV response of the imprinted electrode incubated in different concentrations of benzyl cinnamate for 6 minc(a-g):1.0×10-11 - 1.0×10-8 mol/L,inset:the calibration curve.

在优化的实验条件下，将不同浓度的肉桂酸苄酯标准溶液滴加到电极表面，孵育6 min，然后于含有2.5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L PBS中进行差分脉冲伏安扫描，结果如图6所示。随着肉桂酸苄酯浓度的增加，DPV响应逐渐降低，即电流逐渐减小(图6A)，并且DPV响应和肉桂酸苄酯在1.0×10-11～1.0×10-8mol/L浓度范围内呈线性关系(图6B)，线性方程为:Ip=-9.5452lgc-68.776(Ip：μA,c:mol/L)，其线性相关系数R2为0.9915。由曲线斜率可求得当信噪比为3时，该方法的检测限为2.9 pmol/L。

2.5 分子印迹膜电极的选择识别能力

图7 分子印迹传感器的选择性Fig.7 Selectivity of the molecularly imprinted sensorDPV response of the imprinted electrode in control,1.0×10-8 mol/L benzyl cinnamate,benzyl benzoate and benzyl salicylate.

实验选择肉桂酸苄酯的结构类似物，以及常见共存芳香类过敏原苯甲酸苄酯和水杨酸苄酯作为竞争结合底物，用以评价分子印迹膜电极的特异性选择识别能力。将相同浓度(1.0×10-8mol/L)的肉桂酸苄酯、苯甲酸苄酯、水杨酸苄酯分别滴加到印迹膜电极上孵育6 min，观察其在[Fe(CN)6]3-/4-中的DPV响应，结果如图7所示。在空白溶液中，印迹膜电极的DPV响应为39.1 μA。而在肉桂酸苄酯溶液中孵育6 min后，DPV响应显著降低，电流减小到7.12 μA。但是在苯甲酸苄酯、水杨酸苄酯溶液中，DPV电流降低很小，电流值分别为38.52 μA和38.1 μA。说明印迹膜电极不能识别苯甲酸苄酯和水杨酸苄酯。

2.6 印迹膜电极的再生性和稳定性评价

将5根印迹膜电极在1.0×10-8mol/L的肉桂酸苄酯溶液中孵育6 min后，其DPV电流值的相对标准偏差(RSD)为3.21%。当同一根印迹膜电极在10-8mol/L 的肉桂酸苄酯溶液中孵育和洗脱20次后，依旧有良好的电流响应(RSD=2.97%)。这说明印迹膜电极有很好的再生性和可逆性。

当修饰电极在室温下放置一周后，其峰电流几乎没有变化。放置一个月后，其峰电流值降低到原来的74.8%。这些结果说明印迹膜电极具有良好的稳定性。

2.7 印迹膜电极在洗发水实际样品中的应用能力评价

以当地超市购买的洗发水样品考察印迹膜电极的实际应用可行性。样品经液相色谱分析未检出肉桂酸苄酯。样品中肉桂酸苄酯的添加浓度为10、100、1 000 pmol/L，经处理后进行电化学分析。其添加回收率范围为97.4%～99.84%，RSD为2.92%～3.51%，表明该分子印迹传感器具有良好的实际样品应用检测能力，可以准确地对复杂样品中的痕量肉桂酸苄酯进行定量分析。

3 结论

通过自组装和电沉积的方法在Au电极表面制备了能够特异性结合肉桂酸苄酯的分子印迹膜电化学传感器，构建了一种以[Fe(CN)6]3-/4-为电化学探针，采用差分脉冲伏安法间接测定化妆品中过敏原肉桂酸苄酯的检测新方法。该印迹膜电极具有较高的选择性识别、良好的再生性和稳定性，并且实现了洗发水样品中痕量肉桂酸苄酯的检测。