免疫磁珠法阴性富集循环肿瘤细胞方法的建立

张 磊， 黄慧玲， 杨 昂， 张 茜， 郑春红， 朱玉华， 刘松麟， 李印淑

（亚能生物实验室，广东 深圳 518102）

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）检测对于肿瘤的早期发现、临床诊断、病情监测等具有重要意义，但CTC在肿瘤患者外周血中极为稀少，约为1～10个/mL，而正常成人外周血中血细胞数量为109个/mL，白细胞的数量是（4～10）×106个/mL[1-2]。CTC远低于血液中其他类型的细胞，数量的稀少使得血液CTC检测极具挑战性，加上CTC产生的复杂性、异质性，更增加了其检测的难度[3-4]。因此，如何从数量庞大的背景血液细胞中准确地富集出几个CTC，是CTC检测技术需要解决的关键问题。本研究利用免疫磁珠和免疫荧光技术，建立一种高效、不依赖肿瘤细胞表面标志物、不依赖于肿瘤细胞大小的CTC阴性富集方法和免疫荧光鉴定方法。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

宫颈癌细胞系SiHa（中国科学院细胞库），活细胞荧光染料Celltracker CMFDA（美国Thermo Fisher公司）、Hoechst33342[生工生物工程（上海）有限公司]，荧光显微镜（日本尼康公司）。CTC阴性富集与免疫荧光鉴定试剂由亚能生物技术（深圳）有限公司自主研发，其中试剂A主要包括缓冲液、白细胞去除磁珠；试剂B主要包括细胞固定液、细胞透化液、封闭液、抗体稀释液、抗体浓缩液Ⅰ（含CK-异硫氰酸荧光素）和Ⅱ（含CD45-藻红蛋白）、含DAPI抗淬灭封片剂等。

1.2 方法

1.2.1 细胞计数与掺入 将SiHa细胞加入Celltracker CMFDA染色，用血球计数板精确计数至固定体积内含有6、9、15、30、90、300个不同数量梯度的细胞，并掺入3 mL全血中，每组设6个组内平行。

1.2.2 CTC阴性富集及免疫荧光鉴定 按照CTC阴性富集与免疫荧光鉴定试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 细胞回收率统计 制片后2 d内直接观察计数，7 d后进行荧光染色，CTC表示为细胞核型完整，CK+CD45-Hoechst33342+。CTC富集回收率=染色CTC数量/掺入CTC总数×100%。

2 结果

2.1 CTC阴性富集回收率

在3 mL健康人全血中分别掺入6、9、15、30、90、300个Celltracker CMFDA标记的SiHa细胞，然后进行免疫磁珠阴性富集并进行Celltracker+Hoechst33342+染色、计数，设6批独立试验。富集效率为58.33%～87.22%，平均为76.70%±14.79%，见表1。以3 mL血液中掺入的CTC数量为X，以CTC富集回收数量为Y，线性方程为Y=0.746 4X（r2=0.998 7），说明线性关系良好，见图1。

2.2 CTC检测效率

免疫荧光鉴定后的CTC呈现典型的CK+CD45- Hoechst33342+形态特征见图2。

因Celltracker荧光减弱、淬灭等原因，免疫荧光后CTC平均回收率比免疫荧光前高2.1%～12.6%，7 d后对免疫荧光试剂的影响减到最小，因此于7 d后进行荧光染色。结果显示，CTC回收率为62.50%～95.00%，平均回收率为83.05%，见表2。富集效率和染色回收效率结果对比显示，免疫荧光操作不会减少富集后的CTC数量。

表1 CTC富集数及富集效率

图1 CTC富集平均回收数量线性关系

图2 CTC免疫荧光鉴定

表2 掺入不同数量CTC免疫荧光鉴定前后平均回收率比较 （%）

3 讨论

目前，以上皮细胞黏附分子为肿瘤标志物的CTC分离方法存在漏检丢失上皮性抗原CTC的可能性[3-4]。以美国强生公司Cellsearch为代表的第1代CTC检测技术平台早在2004年就通过美国食品和药品管理局认证，然而由于Cellsearch技术平台捕获CTC数量少、敏感性差、系统封闭，只能用于晚期恶性肿瘤患者，不适用于早、中期肿瘤及治疗后患者，且临床只用于转移性乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌，运用范围窄[5]。因此，开发不依赖于CTC表面标记物、敏感性高、系统开放性强的阴性富集方法对于CTC检测技术具有重要意义。

本研究建立的CTC阴性富集法具有免疫荧光染色效果佳、无非特异性染色等特点，能有效富集血液中极少数量的CTC（3 mL血液中掺入6个细胞，平均能回收3.5个）。这预示着在外周血中含量较低的CTC可被检测出来，更适用于早期诊断、疗效监测及预后判断。且该方法不依赖于CTC表面标志物，可运用于不同类型的肿瘤患者，应用范围更广，但仍需进行大量样本的临床样本研究证实，并且手工操作流程仍有待优化。